柱前衍生化—高效液相色谱法同时测定含油脂药材中8种低分子羰基化合物

　　摘要：目的 建立高效液相色谱法（HPLC）测定含油脂类药材中低分子羰基化合物的方法。方法 苦杏仁等药材经水提取，在酸性条件下，经2，4-二硝基苯肼（DNPH）衍生后，衍生物直接用HPLC测定。色谱柱：Kromasil KR100-5 C18 （250 mm×4.6 mm，5 ?m）；流动相：A为水-乙腈-四氢呋南-异丙醇（59∶30∶10∶1），B为水-乙腈（35∶65），梯度洗脱；流速：0.8 mL/min；检测波长：365 nm；柱温：30 ℃。结果 甲醛、乙醛、丙酮、丙烯醛、丙醛、巴豆醛、2-丁酮、丁醛的DNPH衍生物在一定浓度范围内与峰面积线性关系良好，相关系数均达到0.999以上，平均回收率为88.49%～93.65%，最低检测限为0.002～0.008 ?g/mL。结论 该方法简便、灵敏、准确、重复性较好。
　　关键词：柱前衍生化；低分子羰基化合物；高效液相色谱法；2，4-二硝基苯肼
　　DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2013.12.017
　　中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2013）12-0046-03
　　1995年版《中华人民共和国药典》（一部）首次收载了酸败度检查法，此后历版药典均有收载[1-3]，其中羰基值测定的方法为比色法，测定原理为：在酸性条件下，羰基化合物与2，4-二硝基苯肼（DNPH）反应，生成2，4-二硝基苯腙，再与氢氧化钾作用，生成酒红色共振型离子，在453 nm波长下，测定吸光度，计算出样品中的羰基值。
　　比色法的准确性及重现性差，影响因素较多[4-5]，其中2，4-二硝基苯肼溶液加入量的准确性、测定方法的反应条件、所用试剂的杂质等直接影响该方法的准确性。另外，该方法使用溶剂量大，毒性大，且操作繁琐、时间长等因素，不仅影响结果准确性，且效率低下、不环保。本研究拟克服现有测定方法的弊端和不足，以建立客观、专属的测定方法，对羰基值测定方法
　　进行探索研究。考虑到酸败的产物中主要生成低分子的醛类、酮类化合物，本研究建立含油脂类中药材中甲醛、乙醛、丙酮、丙烯醛、丙醛、巴豆醛、丁酮和丁醛等羰基化合物衍生物的高效液相色谱（HPLC）测定方法，为控制本类产品质量提供依据。
　　1 仪器与试药
　　Shimadzu LC-20AD高效液相色谱仪，二极管阵列检测器（日本岛津），XS205电子天平（梅特勒-托利多仪器有限责任公司），KQ-300E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），TW20恒温水浴锅（Julabo仪器公司）。
　　乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂为分析纯。甲醛、乙醛、丙酮、丙烯醛、丙醛、巴豆醛、2-丁酮、丁醛的DNPH衍生化合物（批号189048，纯度分别为99.9%、99.7%、98.0%、95.0%、99.9%、99.0%、99.0%、99.5%，上海安谱试剂公司）。
　　苦杏仁（批号130205）、炒苦杏仁（批号130214）、桃仁（批
　　号121220）、燀桃仁（批号130105），均购自北京绿野饮片公司。经鉴定，分别来源于蔷薇科植物杏Prunus armeniaca L.及山桃Prunus davidiana （Carr.） Franch.的干燥成熟种子。
　　2 方法与结果
　　2.1 色谱条件及系统适用性试验
　　色谱柱：Kromasil KR100-5 C18（250 mm×4.6 mm，5 ?m）；以水-乙腈-四氢呋南-异丙醇（59∶30∶10∶1）为流动相A，以水-乙腈（35∶65）为流动相B，按表1进行梯度洗脱；流速：0.8 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：365 nm；进样量10 ?L。在上述色谱条件下，各色谱峰分离良好，测定组分均能达到基线分离（见图1）。
　　2.2 对照品溶液的制备
　　分别精密称取甲醛、乙醛、丙酮、丙烯醛、丙醛、巴豆醛、2-丁酮、丁醛的DNPH衍生物对照品适量，加乙腈制成每1 mL各含0.02 mg的混合溶液，即得。
　　2.3 供试品溶液的制备
　　精密称取药材粉末15 g，精密称定，加水30 mL，超声处理（功率300 W，频率40 kHz）1 h，离心，精密吸取澄清液10 mL至25 mL具塞刻度管中，精密加入1 mL 3.0 g/L的DNPH溶液、4 mL醋酸盐缓冲溶液（pH 4.8），加乙腈至刻度，在40 ℃恒温水浴锅中水浴加热90 min，取出放至室温，滤过，取续滤液，即得。
　　2.4 线性关系考察
　　分别精密称取甲醛DNPH衍生物对照品50.67 mg、乙醛DNPH衍生物对照品49.12 mg、丙酮DNPH衍生物对照品49.60 mg、丙烯醛DNPH衍生物对照品49.14 mg、丙醛DNPH衍生物对照品49.14 mg、巴豆醛DNPH衍生物对照品51.18 mg、2-丁酮DNPH衍生物对照品48.91 mg，丁醛DNPH衍生物对照品49.20 mg，置100 mL量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，得到对照品储备液。精密吸取1.0 mL置25 mL量瓶中，加乙腈稀释至刻度。分别精密吸取此混合对照溶液1、2、5、10、15、20、30 ?L，注入高效液相色谱仪，按色谱条件测定，以进样量（?g）为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。结果见表2。
　　1.甲醛DNPH衍生物；2.乙醛DNPH衍生物；3.丙酮DNPH衍生物；
　　4.丙烯醛DNPH衍生物；5.丙醛DNPH衍生物；6.巴豆醛DNPH衍生物；
　　7.2-丁酮DNPH衍生物；8.丁醛DNPH衍生物
　　2.5 精密度试验
　　精密吸取对照品溶液，连续进样6次，每次进样10 ?L，测定各峰峰面积，计算得甲醛、乙醛、丙酮、丙烯醛、丙醛、巴豆醛、2-丁酮、丁醛的DNPH衍生化合物RSD分别为0.07%、1.2%、0.26%、0.11%、0.48%、0.40%、1.9%、0.58%。

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