基于ITS2序列鉴别牡丹皮药材及其混伪品

　　[摘要]该研究应用ITS2序列鉴别牡丹皮药材及其混伪品，以期探索牡丹皮药材准确鉴别的新方法。提取牡丹皮及其混伪品的DNA，目标片段经PCR扩增后测序，通过CodonCode Aligner V3.7.1对测序序列进行质量分析和拼接，基于MEGA 5.0中的K2P模型计算牡丹皮与其混伪品的种内、种间遗传距离及构建系统聚类树。牡丹皮ITS2序列长度为227 bp，种内最大K2P距离为0，它与各混伪品的种间最小K2P距离为0.041，种间平均K2P距离为0.222。由NJ树可知：不同产地来源的牡丹皮药材个体聚为一支，自展支持率为99%，呈现出明显的单系性，能很好地与其混伪品芍药、川赤芍、白鲜皮、朱砂根区分开来。应用ITS2序列可以准确鉴别牡丹皮药材及其混伪品，该方法可以作为传统鉴别方法的有效补充。
　　[关键词]牡丹皮；混伪品；ITS2；鉴别
　　牡丹皮为毛茛科芍药属植物牡丹Paeonia suffruticosa Andr.的干燥根皮^[1]，但在我国有些地区，却将其同属植物芍药P. lactiflora Pall.和川赤芍P. veitchii Lynch、芸香科植物白鲜Dictamnus dasycarpus Turcz.以及紫金牛科植物朱砂根Ardisia crenata Sims的干燥根皮作牡丹皮使用^[2-9]。现代药理研究表明，牡丹皮具有抗菌、抗病毒、抗炎、解热、镇痛、镇静、抗动脉粥样硬化、抗心律失常等多种药理作用^[10-12]。但它的混伪品仅含少量甚至不含其主要活性成分丹皮酚（paeonol）^[13-15]，它们的混用必然会影响牡丹皮药材的使用、研究和开发。而依靠传统的性状、显微和理化鉴别方法既要求操作人员具有较深厚的专业知识，又难以将易混药材准确鉴别到种，这并不适应中医药现代化发展的要求。
　　近年来，DNA条形码（DNA barcoding）技术以其通用性强、易数字化等优点，迅速成为生物分类和鉴定的研究热点。它是利用基因组中一段公认标准的、相对较短的、有足够变异但两端相对保守的序列进行物种鉴定的分子诊断新技术^[16]。在中药鉴定领域，中国学者已提出将ITS2 （internal transcribed spacer 2）序列作为药用植物鉴定的通用条形码序列^[17-23]。本研究应用ITS2序列鉴别牡丹皮及其混伪品，以期探索牡丹皮药材准确鉴别的新方法。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料 本研究通过实地采集、药材市场购买等方式收集未经炮制的牡丹皮及其混伪品样本51份，经中国医学科学院药用植物研究所林余霖研究员鉴定，凭证标本保存于中国中医科学院中药研究所。另从GenBank中下载7条序列（登录号为GQ434607，GQ434600，GQ434601，GQ434602，GQ434603，GQ434841，GQ434842）。样本信息详见表1。
　　1.2 模板DNA的制备 刮去牡丹皮药材及其混伪品的外表皮，取其内部组织约40 mg；加入10% PVP40（原植物叶片中不加），用高通量组织研磨仪（scientz-48，China）在50 Hz条件下研磨120 s；利用植物DNA提取试剂盒（Tiangen Biotech Co.，中国）提取总DNA。提取过程中，向药材粉末中加入细胞裂解液，56 ℃水浴过夜；用氯仿-异戊醇（24∶1）抽提2次；在进行沉淀DNA操作时将沉淀剂改为-20 ℃预冷的异丙醇^[24]。
　　1.3 PCR扩增及测序 ITS2通用引物：正向引物S2F：5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′，反向引物S3R：5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′。反应体系：2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，正反向引物（2.5 μmol·L-1）各1.0 μL，总DNA 2 μL，加ddH2O至25 μL。扩增程序：94 ℃变性5 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s（进行40个循环）；72 ℃延伸10 min^[25]。电泳检查PCR扩增情况，产物经纯化后进行双向测序。
　　1.4 数据处理 对获得的测序序列使用CodonCode Aligner V3.7.1 （Codon Code Co.，USA ）进行质量分析和拼接，去除引物区；采用注释方法（基于隐马尔科夫模型）去除所得序列的5.8S端和28S端以获得ITS2间隔区序列（从GenBank中下载的7条序列均为完整的ITS2序列，不必注释）；将所有ITS2序列用MEGA（molecular evolutionary genetics analysis）5.0进行分析比对，并基于K2P模型（Kimura 2-parameter model）进行遗传距离分析及采用邻接（NJ）法构建系统聚类树^[26]。
　　2 结果与分析
　　2.1 牡丹皮的种内序列分析 牡丹皮药材不同产地样本共20条序列，比对后长度为227 bp，平均GC含量为59.0%，种内无变异位点，种内最大K2P距离为0。
　　2.2 牡丹皮与其混伪品的种间序列分析 芍药17条序列，比对后长度为227 bp，平均GC含量为57.1%；川赤芍7条序列，比对后长度为228 bp，平均GC含量为56.7%；朱砂根7条序列，比对后长度为217 bp，平均GC含量为59.1%；白鲜皮10条序列，比对后长度为222 bp，平均GC含量为63.9%。牡丹皮药材与各混伪品的ITS2序列种间最小K2P距离为0.041，种间平均K2P距离为0.222。本研究中，牡丹皮与其最常见混伪品芍药的3种单倍型的ITS2序列间变异情况见表2。

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