基于DNA条形码—产地—形态联用的药材溯源新方法研究

　　[摘要] 利用NCBI核酸数据库中ITS （internal transcribed spacer） 序列，结合产地分析和形态分析对新发现的一种黑果枸杞混伪品进行溯源研究。通过提取样品DNA，PCR扩增及双向测序，获得样品的ITS序列。所得序列用ContingExpress软件进行拼接，截取ITS序列全长;利用 NCBI核酸数据库中已登录的ITS序列进行相似度分析对其进行DNA条码溯源;根据其产地分析DNA条形码溯源结果;再根据形态特征进一步验证结果，3种方法联用获得溯源结果。新发现的黑果枸杞混伪品来源于小檗科小檗属植物喀什小檗Berberis kaschgarica。与黑果枸杞的主要区别：喀什小檗果实表面平滑，质地轻脆，黑果枸杞表面皱缩，质地坚实而硬;喀什小檗外果皮细胞壁连珠状增厚，石细胞壁平直，层纹不明显，黑果枸杞外果皮细胞壁不增厚，石细胞壁波浪状，层纹明显;喀什小檗的ITS序列长度为606 bp，黑果枸杞的长度为654 bp，二者序列对齐后的相似度为53.32%。
　　[关键词] 黑果枸杞;混伪品;ITS 序列;溯源
　　[收稿日期] 2014-07-05
　　[基金项目] 国际科技合作项目（2011DFA31370）
　　[通信作者] 刘春生，教授，博士生导师，研究方向为药用植物学与分子生药学，Tel：（010）84738624，E-mail：max_liucs@263.net
　　[作者简介] 顾选，硕士研究生，E-mail：guxuan123.love@163.com
　　传统的药材溯源方法是通过产地调研、标本采集和实验室植物分类鉴定等步骤进行[1]，这种方法需要采集到植物完整标本，尤其是花的标本，溯源周期长，不能满足实际工作中的需要。DNA条形码是一段短的DNA片段，能够用于物种识别，其特点是不依赖于植物形态、不受生长发育阶段限制、不依赖于鉴定人员经验，能够鉴定无背景信息的药用植物[2-4]。在DNA条形码中，ITS （internal transcribed spacer） 序列的进化速率适中且具有较高的物种分辨率[5]，已经被广泛地应用到中药材的物种鉴定中[6-9]。但是，由于利用ITS序列进行分子鉴定时还存在着相似度阈值等问题，DNA条形码分子鉴定还不能完全解决药材溯源问题;每种药用植物都有其固定的产地，野生药用植物产地尤其明确，产地信息对中药材溯源也有重要作用;植物的部分信息，如果实形态、颜色等，在科属确定的基础上，对种的鉴别具有重要意义。本文基于以上思路，提出“DNA条形码-产地-形态”联用方法对中药和民族药材进行溯源，弥补传统溯源方法的缺点，为进一步提高中药材质量奠定基础。
　　黑果枸杞为茄科植物黑果枸杞Lycium ruthenicum Murr.的干燥成熟果实[10]，具有补肾益精，养肝明目，补血安神，生津止渴，润肺止咳、清热除蒸、清肺降火、补虚等功效[11]。近年来，在黑果枸杞中发现了具有清除自由基及抗氧化、抗辐射功能的花青素[12-13]，导致黑果枸杞用量猛增，市场价格迅速上涨[14]。作者在对黑果枸杞市场调查时发现，市场中存在一种黑果枸杞，产地为新疆，但种子粒数和显微结构与黑果枸杞不同，这种黑果枸杞是产地变异还是其他物种无法确定，为保证黑果枸杞质量，对其进行品种溯源具有重要意义。本实验拟采取DNA条形码-产地-形态分析相结合的方法对黑果枸杞的这种疑似混伪品进行溯源，为保证黑果枸杞质量提供依据。
　　1 材料
　　黑果枸杞药材3份，来源于青海格尔木，由北京中医药大学刘春生教授鉴定。黑果枸杞的疑似伪品药材3份，来源于新疆喀什市。6份样品的凭证标本均保存于北京中医药大学大学标本室。
　　2 方法
　　2.1 DNA提取和PCR扩增方法
　　取样品，观察形态，形态结果一致。每份样品取3粒果实进行DNA提取。各份样本分别用液氮冷冻后研磨成细粉，采用植物DNA 提取试剂盒（北京博迈德生物有限公司）提取总DNA。采用ITS序列通用引物[6]在PCR扩增仪（TProfessiona型，德国Biometra公司）上进行扩增，PCR扩增条件：50 μL体系含2×Taq PCR MasterMix 25 μL，引物P1和P4各加2.5 μL（5 μmol·L^-1），DNA 模板4 μL，ddH₂O 16 μL。PCR扩增程序： 94 ℃预变性5 min，94 ℃ 变性1 min，55 ℃ 退火1 min，72 ℃延伸1 min，40个循环后，72 ℃延伸10 min。PCR 产物经1%的琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下检视，均由上海生工生物工程有限公司测序部测序。各样品均采用正向和反向测序，以保证测序的准确性。
　　2.2 序列分析方法
　　利用 ContigExpress 软件对测序获得的正、反向序列进行拼接，根据 BLAST所获相似度最高物种的ITS 序列边界，截取待鉴定物种的ITS 序列，然后利用相似度法和系统发育树法分析序列。
　　2.3 基于DNA条形码的溯源方法
　　根据NCBI中BLAST功能，检索NCBI中注册的相似度最高的物种，按照相似度最高的物种截取ITS全长。再利用样品的ITS序列检索，根据属间差异为9.6%～28.8%、种间差异值为1.2%～10.2%的研究结果[15]，种内的差异小于1%[16]，本文以相似度90%以上为属的溯源依据，以相似度99%以上为物种溯源依据，获得溯源结果。
　　2.4 基于产地分析的溯源方法
　　根据2.3项下获得的科属溯源结果，依据《新疆植物志》记载的新疆分布的该属植物物种信息;在NCBI上下载这些物种的ITS序列，通过相似度法、聚类分析法和特异位点法确定物种，获得物种的溯源结果。

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