基于HPLC指纹图谱的黄芩道地药材与非道地药材的鉴别研究

　　[摘要] 目的：比较道地、非道地黄芩的化学成分差异，研究产地、生长方式（野生栽培）对药材化学成分的影响，为黄芩道地药材鉴别和质量评价提供科学依据。
　　方法：采用HPLC指纹图谱方法对不同产地及生长方式的黄芩药材中的化学成分进行检测，采用系统聚类分析、主成分分析及成分组峰面积模式对指纹谱数据进行评价。
　　结果：道地药材与非道地药材指纹谱轮廓特征明显不同。现代道地产区河北承德的黄芩指纹谱除内蒙古赤峰（现代非道地产区）的样品指纹谱特征与其相似外明显区别于其他产地；古代本草上所记载的黄芩产区甘肃庆阳，陕西延安，山东临沂，山西长治、晋中的黄芩样品化学特征相似；现代非道地产区甘肃定西、陇南，陕西商洛的黄芩药材指纹谱特征相似；野生黄芩的阿替苷含量高于栽培黄芩。
　　结论：利用指纹图谱轮廓特征可对道地与非道地黄芩药材进行鉴别区分，该研究结果可为黄芩药材质量控制，以及道地与非道地黄芩药材的药性药效研究提供参考依据。
　　中药黄芩为唇形科植物贝加尔黄芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根，具有清热燥湿、泻火解毒、止血安胎等功效^[1]，目前在我国北方大部分地区都有分布^[2]。现代药理研究表明其主要活性成分为黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素等黄酮类化合物，具有解热、抗炎、抗氧化等活性^[3]，而阿替苷等非黄酮类化合物具有神经保护、改善记忆、抗细胞损伤等作用^[4-5]。
　　道地药材指经过中医临床长期应用优选出来的，在特定地域，通过特定生产过程所产的，较在其他地区所产的同种药材品质佳、疗效好，具有较高知名度的药材。现今习惯以河北承德为黄芩的道地产地[2， 6]，内蒙古、山东、山西、甘肃、陕西等地也有较多黄芩生产。其中甘肃庆阳、陕西延安、山东一带在唐代曾为道地产地，《图经本草》、《证类本草》中记载山西也有黄芩生产^[7-9]。
　　为控制黄芩药材的质量，学者们对不同产地^[10-12]、不同采收期^[13]、不同生长发育期^[14]、不同生长方式（栽培和野生）^[15]以及不同规格^[16]的黄芩药材的指纹图谱进行了研究，并对药材中的黄酮类成分进行了定性定量分析^[17-20]。此外，肖蓉等^[21]还对河北道地药材指纹图谱进行研究，用相似度评价和系统聚类分析的方法提出了道地药材指纹图谱模式。但道地与非道地黄芩药材的化学差异尚不明确，通过指纹图谱进行黄芩产地鉴别尚无直接的参考依据。本课题组在对黄芩道地产地考证的基础上，比较了来源于古代和现代的道地和非道地产地的黄芩的解热和抗炎药效，发现道地产区的黄芩样品作用强于非道地产区的样品，证明了黄芩存在道地性^[22]。为探讨黄芩道地药材的化学特征，本研究从我国北方主要产地收集了野生和栽培黄芩药材共63份，进行了HPLC指纹谱表征和比较，运用主成分分析、聚类分析和成分组峰面积模式比较等方法分析数据，以期为黄芩道地药材鉴别和质量评价提供参考依据。
　　1 材料
　　Agilent 1100 型高效液相色谱仪，配有二元泵、DAD检测器、Agilent化学工作站；Phenomenex Gemini C₁₈色谱柱（4.6 mm× 250 mm， 5 μm）。
　　甲醇（色谱纯，Fisher公司），无水甲酸（分析纯， 天津光复精细化工研究所），双蒸水（娃哈哈饮用纯净水，杭州娃哈哈集团）。提取用甲醇（分析纯，北京化工厂）。黄芩苷（批号110715-200815）、黄芩素（批号111595-200905）和汉黄芩素（批号111541-200403）对照品均购自中国食品药品检定研究院；汉黄芩苷、千层纸素A苷、千层纸素A、阿替苷、白杨素-6-C-α-L-阿拉伯吡喃糖-8-C-β-D-葡萄吡喃糖苷、5，7，2′，6′-4羟基黄酮、粘毛黄芩素Ⅲ，是由北京大学药学院天然药物化学研究室制备，经波谱方法鉴定结构，并用HPLC测定纯度均达到98%以上^[23]。
　　本实验检测药材共计63份（表1），全部药材经北京大学药学院生药学研究室蔡少青教授鉴定为唇形科黄芩属植物贝加尔黄芩S. baicalensis的干燥根，凭证标本存放于北京大学药学院生药标本室。
　　2 方法
　　2.1 供试品制备
　　采集的黄芩药材去除杂质，制成饮片并粉碎。粉碎后的黄芩样品在低温下干燥2 h，迅速精密称定0.5 g，加入70%甲醇50 mL，室温超声提取30 min，静置至澄清，上清液用0.45 μm微孔滤膜过滤，即得。
　　2.2 色谱条件
　　Phenomenex Gemini C₁₈色谱柱（4.6 mm ×250 mm，5 μm）。流动相为1%甲酸溶液（A 相）和甲醇（B相）。梯度洗脱程序为0～10 min，20%～40%B；10～20 min，40%B；20～30 min，40%～46%B；30～45 min，46%B；45～50 min，46%～50%B；50～80 min，50%～80%B。流速1 mL·min^-1，检测波长274 nm，进样量10 μL；柱温30 ℃，梯度洗脱。
　　2.3 色谱峰鉴定
　　利用对照品对黄芩药材中黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、千层纸素A苷、千层纸素A、阿替苷、白杨素-6-C-α-L-阿拉伯吡喃糖-8-C-β-D-葡萄吡喃糖苷、5，7，2′，6′-四羟基黄酮、粘毛黄芩素Ⅲ10个成分进行了指认，并根据各成分的MS裂解规律和紫外吸收特征， 对黄芩指纹图谱中其余的17个主要色谱峰进行了MS鉴定^[24]。

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