基于响应面分析法对烟叶中果胶测定方法的优化

　　摘 要：为了对酶解-连续流动法测定烟叶中果胶含量的方法进行优化，采用Box-Benhnken实验设计及响应面分析法对酶解过程中的酶解温度、酶解时间和缓冲液pH值进行优化。结果显示，酶解温度对果胶测定影响最大，缓冲液pH次之，酶解时间影响最小，且最优酶解条件为酶解时间1.9 h、酶解温度56 ℃、缓冲液pH 3.8；在此条件下，果胶具有良好的线性关系（R2=0.999），加标回收率在99.2%～100.9%，相对标准偏差RSD（n=6）<3%；说明Box-Behnken设计结合响应面分析法优化所得的果胶测定方法具有较好的精密度及准确度，适用于烟叶中果胶含量的批量测定。
　　关键词：响应面分析；连续流动法；烟叶果胶；定量测定
　　中图分类号：TS411 文章编号：1007-5119（2015）05-0085-05 DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2015.05.016
　　Abstract： In order to optimize the method of determining tobacco pectin using enzymolysis-flow method， reaction temperature， enzymatic hydrolysis time and buffer pH were studied through the Box-Benhnken experimental design and response surface methodology. The results showed that reaction temperature had the greatest impact on the determination of pectin， followed by buffer pH， and the enzymatic hydrolysis time comes last. The optimal enzymatic hydrolysis conditions were pH 3.8， time 1.9 h and 56 ℃. Under this condition， the linear relationship of pectin was optimal （R2=0.999）， with the recovery of pectin in tobacco ranged from 99.2% to 100.9%， and the RSD （n=6） was less than 3%. This suggested that the optimized enzymatic hydrolysis conditions used by the Box-behnken design and response surface analysis have good precision and accuracy and are suitable for testing large number of samples.
　　Keywords： response surface methodology； continuous flow method； tobacco pectin； quantitative determination
　　果胶是烟叶细胞壁中胶层的主要组分，其含量集中在5%～9%[1]，其结构主要是半乳糖醛酸以α-1，4糖苷键聚合形成的聚半乳糖醛酸[2]。研究表明，果胶对烟叶保湿能力和柔韧性有着重要的作用[3]；但是，过高的果胶含量在烟草吸食过程中分解产生的甲醇对卷烟安全性具有不利影响[4]。因此，准确测定烟叶中的果胶含量对于评价烟草品质有着重要的意义[5]。
　　目前，果胶测定方法主要有两大类：一类是直接测定果胶酸含量，果胶含量以果胶酸计，如重量法、容量法为主[2]，该类方法操作复杂且重复性差，目前已较少采用；另一类是通过酸解或者酶解将果胶水解，采用现代分析仪器测定水解产物半乳糖醛酸含量，并以半乳糖醛酸来计果胶含量，如咔唑比色法[2]、色谱法[6-12]和酶解-连续流动法[13-15]等。其中，比色法基质干扰较大而造成测定结果偏高[7-9]，色谱法虽然具有较好的灵敏度及选择性，但是该方法由于仪器操作复杂、检测成本高等特点而难以推广应用。近年来，酶解-连续流动法是一种备受关注的测定烟草中果胶含量的新方法，该方法条件温和、解聚率高且重现性好[16]。然而，果胶酶酶解过程中的酶解温度、酶解时间及缓冲液pH是影响准确测定果胶含量的重要因素。为了更为客观地反映上述三因素对酶解过程的影响及其交互效应，文中采用响应面分析法优化了果胶酶对烟叶中果胶的酶解条件，为采用酶解-连续流动法准确测定烟草中果胶含量提供参考。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料和仪器
　　冰乙酸、无水乙醇、氢氧化钠、盐酸、氯化钙（AR，四川西陇化工有限公司）；对羟基苯甲酸酰肼（纯度：98%，ACROS公司）；半乳糖醛酸（纯度≥97.0%，FLuka公司）；果胶酶（酶活力：30000 U/g，阿拉丁）；果胶（含量≥74.0%，美国Sigma-Aldrich公司）；柠檬酸和柠檬酸三钠（AR，上海国药集团）；0.45 μm水系微孔滤膜（Φ13 mm×0.45 μm，津腾）；滤纸（Φ12.5 cm，杭州特种纸业有限公司）；烟叶样品。
　　AA3流动分析仪（德国布朗卢比公司），SHB-III循环水式真空泵（巩义市予华仪器有限公司SHZ-D），MS204S电子天平（d=0.1 mg，瑞士梅特勒公司），电热恒温水浴锅（DZKW-S-6北京市永光明医疗仪器有限公司），水浴恒温振荡器（SHA-B金坛市金南仪器厂）和Milli-超纯水系统。
　　1.2 实验方法

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