HPLC法同时测定不同产地甘草药材中甘草酸和甘草苷的含量

　　【摘要】目的：测定不同产地甘草药材中甘草酸和甘草苷的含量。方法：采用HPLC法，检测波长为237 nm，流动相为0.05%磷酸溶液-乙腈。结果：甘草苷和甘草酸的线性范围分别为0.050~ 0.375 μg和0.40~3.00 μg，平均回收率分别为100.15%和98.76%。结论：所建HPLC方法操作简便、准确、重复性好，可为不同产地甘草药材的质量评价提供依据。
　　【关键词】高效液相色谱法；甘草；甘草酸；甘草苷；含量测定
　　Determination of glycyrrhizic acid and liquiritin in
　　Glycyrrhizae radix et rhizoma by HPLC
　　Li Ru-Jie
　　(Pharmacy of Sichuan Orthopaedic Hospital, Chengdu 610041, China)
　　【Abstract】Objective: To establish an HPLC method for determining the contents of glycyrrhizic acid and liquiritin in Glycyrrhizae radix et rhizoma. Methods: The mobile phase was acetonitrile and water containing 0.05% phosphoric acid. The detection wavelength was set at 237nm. Results: The linear range of glycyrrhizic acid and liquiritin was 0.40~3.00 μg, 0.050~ 0.375 μg and the average recovery was 98.76%, 100.15%, respectively. Conclusion: The developed method is simple, accurate, and can provide a scientific basis for the quality evaluation of Glycyrrhizae radix et rhizoma.
　　【Key words】HPLC; Glycyrrhizae radix et rhizoma; Glycyrrhizic acid; Liquiritin; Content determination
　　【中图分类号】R285.5【文献标识码】A【文章编号】2095-6851（2014）06甘草始载于《神农本草经》，列为上品。《中国药典》2010年版规定甘草为豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.、胀果甘草Glycyrrhiza inflata Bat.或光果甘草Glycyrrhiza glabra L.的干燥根和根茎［1］。甘草味甘、平，具有补脾益气、清热解毒、祛痰止咳、调和诸药的功效，临床上多用于治疗脾胃虚弱、倦怠乏力、心悸气短、四肢挛急疼痛等症［1］。
　　甘草主要含三萜皂苷和黄酮类成分，如甘草酸、甘草苷、甘草素等［2-3］。现代研究表明，甘草酸和甘草苷是甘草中主要的生物活性物质，甘草酸具有抗炎、保肝、抗肿瘤等作用［4］，甘草苷能抗抑郁、保护神经细胞，并对肝脏毒性有明显的保护作用［5］。本文采用HPLC法测定了不同产地甘草药材中甘草酸和甘草苷的含量，为甘草药材的质量评价提供了参考依据。
　　1仪器与试药
　　美国Agilent 1260高效液相色谱仪；CQ-250超声波清洗器（上海必能信有限公司）；Sartorius BP121s电子天平 (北京赛多利斯科学仪器有限公司)。乙腈为色谱纯（Fisher），水为超纯水，乙醇、磷酸等试剂均为分析纯。甘草苷对照品（批号：111610-200604）和甘草酸铵对照品（批号：0731-9704）均购自中国药品生物制品检定所。本文共收集了10批甘草药材，主要产于内蒙古、新疆、甘肃和宁夏等地。
　　2方法与结果
　　2.1 色谱条件
　　Zorbax SB-C18色谱柱(4.6 mm × 150 mm, 5 μm)；检测波长：237nm；柱温：30 ?C；流速：1.0 mL/min；进样量：10 μL；流动相：A相为0.05％磷酸溶液，B相为乙腈，进行梯度洗脱，洗脱程序为：0~8 min, 19%~19% B；8~35 min, 19%~50% B；35~36 min, 50%~100% B；36~40 min, 100%~19% B。
　　2.2 对照品溶液的制备
　　取甘草苷对照品、甘草酸铵对照品适量，精密称定，加70%乙醇制成每1ml含甘草苷25μg、甘草酸铵0.2mg的混合对照品溶液，即得（甘草酸重量 = 甘草酸铵重量/1.0207）。
　　2.3 供试品溶液的制备
　　取本品粉末约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇100ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
　　2.4 线性关系考察
　　取甘草苷、甘草酸铵对照品适量，精密称定，加70%乙醇制成每1ml含甘草苷25μg、甘草酸铵0.2mg的混合对照品溶液。再分别精密吸取2、3、5、8、10、15μL混合对照品溶液，注入液相色谱仪，测定峰面积。以对照品进样量(μg)为横坐标，相应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。结果甘草苷的回归方程为Y = 2426.7 X - 0.1355（r = 0.9999），线性范围为0.050~ 0.375 μg；甘草酸的回归方程为Y = 443.54 X - 1.3603（r = 0.9999），线性范围为0.40~3.00 μg。
　　2.5 方法学考察
　　2.5.1 精密度试验
　　精密吸取同一混合对照品溶液10 μL，按上述色谱条件，连续进样6次，记录色谱峰面积，结果甘草苷、甘草酸峰面积的RSD分别为1.18%、1.45%，表明仪器精密度良好。
　　2.5.2稳定性试验
　　取同一供试品溶液，于制备后0、1、2、4、8、12 h进行测定，记录峰面积，计算2种成分的峰面积RSD。结果甘草苷和甘草酸峰面积的RSD分别为1.58％、2.06％，表明供试品溶液在12 h内稳定。
　　2.5.3重复性试验
　　取同一批样品粉末约0.2 g，共6份，精密称定，按上述供试品溶液制备方法分别制备供试品溶液。在上述色谱条件下，依法测定，计算甘草苷和甘草酸的含量。结果甘草苷和甘草酸含量的RSD分别为2.08%、2.26%，表明该方法重复性良好。
　　2.5.4加样回收试验
　　取同一批已知含量的甘草样品粉末9份，每份约0.1 g，精密称定，分别按已知含量的80%，100%，120%三个水平加入对照品，再按上述供试品溶液制备方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下测定甘草苷和甘草酸的含量，计算回收率。结果甘草苷的平均回收率为100.15%，RSD为2.07%；甘草酸的平均回收率为98.76%，RSD为1.72%。
　　2.6 样品含量测定
　　分别取不同产地的甘草药材粉末约0.2g，精密称定，按上述供试品溶液制备方法制备供试品溶液。精密吸取各供试品溶液10μL，注入高效液相色谱仪，依法测定，计算甘草苷和甘草酸的含量。对照品及甘草供试品溶液的HPLC色谱图见图1，含量测定结果见表1。
　　
　　图1 对照品（A）和甘草供试品（B）的HPLC图谱
　　表1不同产地甘草药材中甘草苷和甘草酸的含量测定结果(n=3)
　　编号药材
　　产地甘草苷
　　含量（%）甘草酸
　　含量（%）编号药材
　　产地甘草苷
　　含量（%）甘草酸
　　含量（%）1内蒙古
　　和林格尔1.244.126内蒙古
　　依克昭盟1.143.982内蒙古
　　鄂尔多斯1.093.517新疆吉
　　木萨尔0.853.863新疆
　　和静0.984.068甘肃
　　庆城1.052.764甘肃
　　陇西0.752.989宁夏
　　盐池0.823.385宁夏0.813.2410甘肃
　　酒泉0.683.05
　　3讨论
　　在供试品溶液制备时，考察了乙醇、70%乙醇、50%乙醇、甲醇、70%甲醇溶剂的提取效率，结果70%乙醇对两个成分的提取效果最佳；考察了不同提取方法（超声、冷浸和水浴回流），结果超声比回流、冷浸提取的效率更高。此外，还对提取时间、提取次数、溶媒用量等参数进行了考察，最终确定了最佳的供试品溶液制备方法。 《中国药典》2010年版“甘草”项下规定：按干燥品计算，甘草药材含甘草苷不得少于0.50%，甘草酸不得少于2.0%。本文研究发现，产于内蒙古、新疆、甘肃和宁夏等地的10批药材中甘草苷和甘草酸的含量均符合规定，表明收集的甘草药材质量均合格。其中，产于内蒙古和林格尔县的甘草药材中的甘草苷（含量为1.53%）和甘草酸（含量为4.12%）含量最高，而来自于甘肃酒泉的甘草药材中的甘草苷含量最低，为0.68%。
　　参考文献
　　［1］中华人民共和国药典一部［S］. 北京：中国医药科技出版社，2010，80.
　　［2］李薇，宋新波，张丽娟，等. 甘草中化学成分研究进展［J］. 辽宁中医药大学学报，2012，14（7）：40-44.
　　［3］ 陶晡，刘晓清，屈振刚. 甘草化学成分研究进展［J］. 河北农业科学，2009，13（3）：77-79.
　　［4］韩瑶聃，王彬，王政雨，等. 甘草酸药理作用的研究进展［J］. 中国新药杂志，2012，21（21）：2499-2505.
　　［5］冯月，吴文夫，魏建华，等. 甘草酸及甘草苷的提取纯化方法和药理作用研究进展［J］. 人参研究，2012，3：46-50.

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