基于ITS2和?psbA—trnH?序列对细小种子类药材车前子的鉴定比较

　　[摘要]为考察ITS2 序列和psbA-trnH 序列对车前子药材及其常见混伪品的鉴定能力，该研究对车前子2个基原物种及7种混伪品共71份样本进行了研究。采用MEGA 5.1对获得的ITS2和psbA-trnH进行序列比对，计算种内和种间kimura 2-parameter（K2P）遗传距离，并构建系统发育树。结果显示，车前和平车前的ITS2 序列长度分别为199，200 bp；两者的ITS2序列种内最大 K2P 遗传距离均小于与混伪品的最小种间K2P 遗传距离；基于ITS2 序列构建的NJ 树中，车前、平车前及其混伪品都表现出良好单系性，都能相互明显区分。表明ITS2序列能将车前子药材与混伪品进行很好的区分。车前和平车前的psbA-trnH序列长度均为340 bp，两者的psbA-trnH 序列种内最大K2P 遗传距离小于与混伪品的最小种间K2P 遗传距离；基于psbA-trnH 序列构建的NJ 树结果显示，除大车前外，车前子药材与其余混伪品可以明显区分。因此，ITS2序列作为DNA条形码，车前子及其混伪品具有良好的鉴别能力，对保障车前子用药安全具有重要意义。
　　[关键词]车前子；混伪品；DNA 条形码；ITS2 ；psbA-trnH
　　车前子为车前科植物车前Plantago asiatica L. 或平车前P. depressa Willd. 的干燥成熟种子，具有清热利尿通淋、渗湿止泻、明目、祛痰等功效^[1]。车前子为常用中药材，始载于《神农本草经》并列为上品。目前，车前子的鉴别多从外观性状、显微鉴别和理化等方面进行研究^[2-4]。车前子常见的混伪品有大车前、长叶车前、葶苈子、青葙子、菟丝子等^[4]。由于车前子及其混伪品都属于极细种子类药材，从外观形态上很难将其进行区分，传统的鉴定方法已经无法满足目前的要求，急需一种快速准确的鉴定方法，以确保临床用药安全。
　　DNA 条形码技术是当今生物分类和鉴定的研究热点和方向。该技术简便高效，不受样品的形态限制，能对中药材进行准确鉴定^[5-7]。国家药典委员会于2012年讨论并通过在《中国药典》（2010年版）增补本中列入《中药材DNA 条形码分子鉴定指导原则》，该指导原则通过对大样本量中药材进行DNA 条形码分子鉴定研究，建立以ITS2序列为核心、psbA-trnH 序列为辅的植物类药材DNA 条形码鉴定体系^[8]。
　　本研究以车前子药材及其常见混伪品作为研究对象，验证ITS2 序列以及psbA-trnH 序列作为DNA 条形码对车前子药材及其混伪品鉴定的稳定性和准确性，保障车前子用药安全。
　　1 材料
　　本研究共收集71份样本，其中车前子药材共39份（车前32份，平车前7份），车前子基原植物样本共9份（车前5份，平车前4份），混伪品7个物种共32份样本，样品来源见表1。样品经中国医学科学院药用植物研究所林余霖研究员鉴定，凭证标本保存于中国中医科学院中药研究所。
　　2 方法
　　2.1 DNA提取 取药材或硅胶干燥的叶片约40 mg，用高通量组织研磨仪（Sceintz-48，宁波新芝）研磨2 min （30次/min），使用植物基因组DNA 提取试剂盒（Tiangen Biotech Co.，China）提取总DNA。
　　在提取过程中，样品研磨后加入700 μL 核分离缓冲液抽提3次，加入细胞裂解液56 ℃水浴8～9 h。其余步骤按DNA 提取试剂盒操作说明进行。
　　2.2 PCR扩增及测序 ITS2序列和psbA-trnH序列PCR扩增引物及反应条件参见《中药DNA条形码分子鉴定》^[9]，PCR 扩增产物经琼脂糖电泳检测并纯化后，使用ABI 3730XL （Applied Biosystems Co.，USA）测序仪进行双向测序。
　　2.3 数据处理 获得的测序峰图采用CodonCode Aligner V3.7.1（CodonCode Co.，USA）校对拼接，去除引物区及低质量区。使用隐马尔可夫模型HMMer序列注释方法^[10]去除两端5.8S和28S区段，获得ITS2 序列。通过与GenBank序列进行Blastn比对，通过参考序列进行注释，获得psbA-trnH 序列。用软件MEGA 5.1进行序列比对^[11]，基于Kimura-2-parameter （K2P）模型计算遗传距离，并用邻接（NJ）法构建系统聚类树，利用bootstrap（1 000次重复）检验各分支的支持率。
　　3 结果与分析
　　3.1 车前子药材DNA提取及PCR扩增效率 由于车前子中含大量黏液质（多糖类化合物）^[12-14] ，按照常规方法提取车前子DNA，提取效率较低。本文在大量实验的基础上，通过改进DNA提取方法，可以成功提取所有样品DNA，其PCR产物电泳后均可显示出单一目的条带，ITS2序列和psbA-trnH序列的扩增效率均可达到100%。经双向测序后，能得到高质量的ITS2序列和psbA-trnH序列。
　　3.2 车前子药材及其混伪品ITS2序列特征 车前和平车前ITS2序列长度分别为199，200 bp，G+C含量分别为54.7%，52.9%。来自于北京、重庆、浙江杭州等15个产地的36条车前ITS2序列种内无任何变异位点，序列相似性100%；来自于北京、吉林长白山、河北涿州等5个产地的12条平车前ITS2序列仅1个变异位点，可分为2个单倍型（表1），其中单倍型B1共10条序列，单倍型B2共2条序列，见表2。与平车前12条ITS2序列比对后，发现36条车前序列在33 bp处有一个稳定的碱基缺失。

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