贝母类药材湖北贝母Fritillaria,hupehensis系统位置的探讨——来自ITS，rpl16，mat,K序列的证据

　　[摘要]湖北贝母为传统中药，然而《Flora of China》将其基原植物湖北贝母Fritillaria hupehensis归并于天目贝母F.monantha项下。该实验采用分子系统学方法，以川百合Lilium davidii为外类群，用核基因ITS序列和叶绿体基因rpl16序列、matK序列等3个片段对湖北贝母及其近缘类群天目贝母F.monantha、安徽贝母F. anhuiensis等进行联合建树分析，对湖北贝母植物的系统位置进行了探讨，为湖北贝母药材的安全使用提供分子证据。结果显示，分子系统树上，3种贝母各自的居群聚为一支，之后天目贝母与安徽贝母聚为一支，最后与湖北贝母聚为一支。表明湖北贝母与天目贝母的亲缘关系可能要远于安徽贝母与天目贝母之间的关系，因此不适宜将湖北贝母归并于天目贝母。
　　[关键词]湖北贝母； 天目贝母； 安徽贝母； ITS； rpl16； matK
　　贝母为我国传统中药，具有清热化痰，止咳散结的功效，2010年版《中国药典》^[1]中记载了5个品种的贝母类药材，分别是川贝母、浙贝母、湖北贝母、伊贝母和平贝母，涵盖了贝母属植物10种1变种。贝母属植物主要分布于北半球的温带地区，全世界130多种，中国有20多种，除《中国药典》记载的种类外，在中国民间，其余贝母属物种也多作为贝母类药材的代用品使用。然而，由于形态性状变异复杂，加之可能存在的种间杂交^[2-3]，使得该属，特别是东亚地区物种分类处理并不十分清晰，这直接导致了药材使用上的不便，如药材湖北贝母的基原植物湖北贝母Fritillaria hupehensis为《中国药典》2010年版所收录，中文版《中国植物志》^[4]也承认该种的成立，然而随后《中国植物志》的同一作者却出版了截然不同的意见，陈心启等^[3]在讨论长江中下游地区的贝母属分类时，认为湖北贝母的性状变异幅度在广义的天目贝母F.monantha性状变异范围内，进而在2000年出版的《Flora of China》中将湖北贝母作为天目贝母的异名处理。这一处理是建立在形态学基础上的，是否合理应该得到更多其他领域的数据支持，有待进一步深入研究探讨。
　　近十几年来，随着分子直接测序技术的普及，DNA序列片段已经被广泛运用于植物系统学的研究。ITS为核核糖体DNA内转录间隔区，具有较快的进化速率，适于用来解决一些较低分类阶元的问题，应用最为广泛。叶绿体基因为单拷贝基因，有利于系统树的构建。rpl16是cpDNA中进化速率最快的内含子之一，一般用于较低分类阶元或近缘类群间^[5]。matK是叶绿体基因组的蛋白编码区中进化最快的基因之一，也是近年中分子系统发育研究中使用频率最高叶绿体片段之一^[6]。在国外尤其是中东地区，有关贝母属分子系统的研究较为深入，但国内这方面的报道还很少见，本实验根据国外贝母属分子系统学研究基础^[7]选择ITS，rpl16，matK 3个序列片段，对中国贝母属下的部分植物开展分子系统学研究，焦点集中于与天目贝母和湖北贝母亲缘关系较近的几个物种，以期利用分子证据解决分类系统难题，同时也为贝母类药材基源的准确分类和应用提供更多的证据。
　　1 材料与方法
　　1.1 样品采集 用于本实验中湖北贝母、天目贝母及亲缘关系较近的贝母属植物均采自模式产地的野外或栽培居群，为硅胶干燥的新鲜叶片，可以较好的代表该种贝母植物，来源见表1。植物标本由北京药用植物研究所张本刚研究员鉴定，凭证标本保存于北京协和医学院药用植物研究所资源中心。另外伊贝母以及作为外类群分析用的川百合序列来源于GenBank。
　　1.4 PCR扩增与测序 PCR扩增反应在ABI 2720PCR扩增仪上进行。PCR酶采用北京艾德莱生物科技有限公司的2×Taq PCR Master Mix。
　　PCR扩增反应体系25 μL：12.5 μL Master Mix，引物（ITS 2.5 μmol·L^-1；rpl16，matK 5 μmol·L^-1） 各1，2 μL总DNA样品，8.5 μL ddH2O。
　　PCR扩增程序为：94 ℃预变性（ITS 3 min；rpl16，matK 5 min）；94 ℃变性1 min，退火1 min（ITS 58 ℃；rpl16 54 ℃；matK 53 ℃ ），72 ℃延伸（ITS，rpl16 2 min；matK 2.5 min）；循环数（ITS 32；rpl16，matK 35 ）；72 ℃延伸（ ITS 5 min；rpl16，matK 7 min）；4 ℃保存。
　　1.5 序列测定 PCR 产物的纯化和序列测定均由中美泰和生物技术（北京）有限公司完成。 PCR 产物直接双向测序，测序引物为PCR引物。为保证测序顺利，部分样品的matK序列加测了中间引物。
　　1.6 序列分析 所测序列用CodonCode Aligner 3.7.1（Condon Code Co.，Germany）进行校对拼接，然后用MEGA5.2对其与从GenBank中下载的序列进行比对。以川百合为外类群，采用对最大简约法（maximum parsimony， MP）、最大似然法（maximum likelihood， ML）对3个序列进行联合构建系统树：最大简约树的构建采用PAUP4.0b10进行，使用启发式搜索，TBR分支交换算法；最大似然树的构建采用MEGA5.2进行，使用T-3-P + G的模型。最大似然使用的模型由MEGA5.2计算所得。用靴带分析（bootstrap）1 000次重复检验分支的可靠性，空缺（gap）始终做缺失（missing）处理。
　　2 结果与分析

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