对照提取物用于当归药材质量控制的研究

　　[摘要]为提高当归药材的质量标准，解决部分对照品稀缺问题，进行了以对照提取物为对照的当归药材质量控制研究。采用色谱分离技术制备对照提取物，并对其中3个指标成分阿魏酸、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H进行标定，建立了以对照提取物为对照的当归药材UPLC含量测定方法，并采用t检验对以对照提取物和对照品为对照的测定结果进行比较，结果基本一致，该方法可用于当归药材质量控制，且经济实用，本研究初步验证了其可行性。
　　[关键词]当归；对照提取物；质量控制
　　中药材中活性成分的含量是决定其质量优劣、有效性和安全性的主要因素，因此成分的定量分析是中药材质量控制的关键。同时中药的复杂性决定了以单一成分为指标难以全面地评价其质量，多成分含量测定逐渐成为中药质量控制的趋势。然而这种质量评价模式，却受到中药化学对照品分离难度大、单体不稳定或供应价格高等因素的制约^[1]，限制了其在中药生产企业的推广应用^[2]，导致中药质量标准提高的步伐迟缓。“一测多评”的含量测定方法在一定程度上解决了中药对照品缺失、价格昂贵及不稳定的问题，现已在丹参、黄连、金银花等多种药材的多成分定量分析和多指标质量控制中得到应用3-5，但此法在相对校正因子的定量、指标成分的色谱峰定性，尤其是方法的实用性和耐用性方面尚存在一些问题^[6]。开发中药对照提取物可能成为有效措施之一^[7]，对照提取物为中药的“标准”提取物，其组分比例相对固定，且指标性成分含量已经采用相应的对照品进行标定，可配制成不同浓度的系列标准溶液，用于中药材多成分分析^[8]，尤其适用于组分明确但单体对照品不易获得的成分测定。目前以对照提取物为对照的含量测定方法仍处于起步和探索阶段，关于其用于中药质量控制的适用性和可行性报道较少。
　　当归是中医临床常用药材，为伞形科植物当归Angelica sinensis （Oliv.）Diels的干燥根。目前，关于当归质量控制方法的研究很多，定性方面以薄层色谱鉴别和指纹图谱研究为主，含量测定方面主要是以单成分阿魏酸为指标，阿魏酸普遍存在于多种中药材中，专属性较差，仅以其为指标不能全面地评价当归药材质量^[9-11]。同时当归中的一些活性成分如藁本内酯、丁烯基苯酞等的稳定性差，在实际应用中难以作为质控指标进行药材的质量控制^[12-13]。本实验制备对照提取物操作简便且成本较低，可在两类成分上控制当归药材质量，同时解决了洋川芎内酯I及洋川芎内酯H对照品缺乏、价格昂贵等问题，建立了以对照提取物为对照的当归药材多成分含量测定方法，为其更为全面、专属性更好的质量控制提供了科学依据。
　　1 仪器与试药
　　Reveleris X2全息快速纯化色谱系统（GRACE公司）；ACQUITY UPLC系统（二元高压泵，自动进样器，柱温箱，二极管阵列检测器，Waters公司）；MF-MS105电子分析天平（METTLER TOLEDO公司）；EPED-E2-30TF超纯水系统（南京易普易达科技发展有限公司）；KH -300型超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）。
　　对照提取物自制；阿魏酸对照品（批号110773-201012，供含量测定用），购于中国食品药品检定研究院；洋川芎内酯I（批号130601，供含量测定用）、洋川芎内酯H（批号130816，供含量测定用），均购于成都克洛玛生物科技有限公司；当归药材信息见表1，经南京中医药大学段金廒教授鉴定，均为伞形科植物当归A. sinensis的干燥根。
　　2 方法与结果
　　2.1 对照提取物的制备
　　甘肃岷县当归药材，切片，8倍量70%乙醇浸泡0.5 h，回流提取2次，每次1.5 h，合并提取液，减压回收溶剂浓缩成稠膏。将稠膏与硅胶1∶1均匀拌样，于80 ℃真空干燥，以含样硅胶与空白硅胶1∶12干法上样，用Reveleris X2中压制备系统快速去除藁本内酯等极性小的成分，收集阿魏酸（1）、洋川芎内酯H（2）、洋川芎内酯I（3）部位，洗脱条件见表2，制备色谱图见图1。将收集得到的阿魏酸、洋川芎内酯H、洋川芎内酯I部位回收溶剂，得浅黄色油状物。用适量甲醇溶解，使阿魏酸的质量浓度2.5～3.0 g·L^-1，0.22 μm微孔滤膜滤过，将滤液封装于安瓿瓶中，即得所需的对照提取物。
　　2.2 对照提取物的标定
　　2.2.1 对照品溶液配制 精密称取阿魏酸对照品28.50 mg、洋川芎内酯I对照品10.70 mg、洋川芎内酯H对照品2.06 mg，分别置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，得各单一对照品储备液。分别精密吸取上述对照品储备液1 mL，置于10 mL量瓶中，加70%甲醇定容，配制成含阿魏酸114 mg·L^-1、洋川芎内酯I 42.8 mg·L^-1、洋川芎内酯H 8.24 mg·L^-1的混合对照品溶液，再用70%甲醇逐级稀释成一系列浓度的混合对照品溶液（浓度分别为阿魏酸：114，57.0，28.5，14.2，7.12，3.56 mg·L^-1；洋川芎内酯I：42.8，21.4，10.7，5.35，2.68，1.34 mg·L^-1；洋川芎内酯H：8.24，4.12，2.06，1.03，0.515，0.258 mg·L^-1）。
　　2.2.2 供试品溶液配制 精密吸取自制对照提取物1 mL，置于100 mL量瓶中，加70%甲醇定容，即得。
　　2.2.3 色谱条件 利用混合对照品建立工作曲线，见表3，并进行方法学验证，色谱条件如下：ACQUITY UPLCR BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）色谱柱；流动相：甲醇（A）-0.1%醋酸水溶液（B），梯度洗脱[ 0～3 min，A-B （15∶85～35∶65）；3～4 min，A-B （35∶65～37∶63）；4～5 min，A-B （37∶63～37∶63）；5～8 min，A-B（37∶63～45∶55）；8～9 min，A-B（45∶55 ～15∶85）]；流速0.3 mL·min^-1；柱温30 ℃；检测波长280 nm；进样量5 μL；以阿魏酸计理论塔板数不低于8万。在该色谱条件下，3个成分与相邻组分达到基线分离，分离度均大于1.5。3批对照提取物含量标定结果，见表4，混合对照品、对照提取物及药材的UPLC图，见图2。

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