太子参药材的快速分子鉴定

　　[摘要]为建立一种简便快捷的太子参分子鉴定方法，对太子参药材及其混伪品的rDNA-ITS片段进行比对分析，找出特异性片段，设计太子参鉴别引物，并优选扩增条件，扩增产物经100×SYBR Green I染色后紫外光下观察。结果显示，PCR扩增反应液（包括DNA Taq聚合酶预混液5.5 μL，Tzs-2F，Tzs-2R各10 pmol，DNA模板20～80 ng，双重灭菌蒸馏水加至25 μL）经95 ℃预变性1 min，95 ℃变性5 s，56 ℃退火延伸15 s，30个循环，72 ℃后延伸30 s后，在扩增产物中加入1 μL 100×SYBR Green I混匀后于紫外光下呈绿色荧光的为太子参，混伪品无绿色荧光出现。40 min内即可完成DNA提取、扩增等整个鉴定过程。该方法能特异性扩增太子参DNA，紫外光下肉眼观察即可鉴定药材的真伪，且操作简捷、结果准确、利于推广，可为快速鉴定中药材的真伪提供参考。
　　[关键词]太子参；分子鉴定；特异性PCR；SYBR Green I
　　太子参为石竹科植物孩儿参Pseudostella riaheterophylla（Miq.）Pax ex Pax et Hoffm的干燥块根，具有益气健脾、生津润肺的功效，用于脾虚体倦、食欲不振、病后虚弱、气阴不足、肺燥干咳等症的治疗^[1]。作为药食两用品种，太子参近年来得到了广泛的开发与利用。为牟取私利，市场上出现以淡竹叶Lophatherum gracile Brongn.、繁缕Stellaria media （L.） Cirillo、宝铎草Disporum sessile D. Don、直立百部Stemona sessilifolia （Miq.） Miq.、阔叶山麦冬Liriope platyphylla F. T. Wang & Tang、矮小山麦冬L. minor （Maxim.） Makino等植物的根或块根冒充太子参销售^[2-5]。其外形与太子参较为相似，特别是加工粉碎后，药材饮片特征消失、细胞差异不明显、理化反应繁锁等等。针对这种传统鉴定方法难以准确判定的易混药材，建立一种操作简捷、结果准确可靠的新型鉴定方法具有现实价值和实践意义。
　　DNA分子鉴定方法是根据基因组序列进行比较研究，在很大程度上弥补和克服了传统鉴定的缺陷和难题。其中的特异性PCR是根据正品、伪品药材特定区域的DNA序列，设计有高度特异性的正品鉴别引物，此引物能有效扩增来自正品药材DNA模板中的特定区域。鉴定样品时，用鉴别引物对所提取样品的DNA进行PCR扩增，经凝胶电泳检测鉴别样品真伪^[6]。但电泳过程繁琐、耗时，所用溴化乙锭（EB）试剂污染环境和危害人体健康^[7]。探讨一种更安全、更灵敏的分子标记检测方法将有助于特异性PCR鉴定技术的推广及大规模样品的鉴定。
　　本文针对太子参及其常见混伪品（淡竹叶、繁缕、宝铎草、禾叶山麦冬、阔叶山麦冬、矮小山麦冬、直立百部、蔓生百部、对叶百部）的物种DNA，采用特异性PCR鉴定技术对DNA进行特异性片段扩增，然后在扩增产物中加入DNA核酸荧光染料SYBR Green I，紫外光下观察荧光反应的有无，从而判断太子参药材的真伪。这是一种不需要凝胶电泳操作，即可准确鉴定太子参药材的快速分子鉴定方法。
　　1 材料
　　实验材料太子参药材购于贵州施秉、安徽宣城、江苏句容、福建柘荣、山东临沂等地，共37份样本，每份样本500～1 000 g，按产地混合后四分法取100 g打粉。另收集到太子参伪品共41份，分别为宝铎草、繁缕、直立百部、蔓生百部、对叶百部、阔叶山麦冬、禾叶山麦冬、矮小山麦冬、淡竹叶，均为块根，每份样本100～200 g，按产地混合后四分法取100 g打粉。实验材料样本数及产地见表1。样品经贵阳中医学院生药教研室江维克教授鉴定。
　　琼脂糖（西班牙Biowestagarose）；D2 000，10 000× SYBR Green I核酸染料（北京索莱宝科技有限公司）；2×Power Taq PCR MasterMix（北京百泰克生物技术有限公司）；EB，2×Taq PCR MasterMix（北京天根生化科技有限公司）；Premix Ex TaqTM Version 2.0（宝生物工程大连有限公司）；其他试剂均为分析纯。
　　PCR仪（Mastercycler，德国Eppendof）；核酸定量分析仪（NANODROP 2000，美国Thermo）；凝胶成像系统（GGM/D2，英国SYNGENE）；电脑三恒多用电泳仪（DYY-12，北京六一仪器厂）；自动蒸汽灭菌锅（ES-315，日本Tomy）；低温高速冷冻离心机（Centrifuge 5810R，德国Eppendof）；三用紫外仪（ZF-2，上海市安亭电子仪器厂）。
　　2 方法
　　2.1 基因组DNA的提取及检测 采用碱裂解法提取各药材样品基因组DNA^[8-9]，核酸定量分析仪检测DNA的浓度及纯度。用通用引物ITS2F/ITS3R^[10]扩增样品DNA以验证模板DNA的质量。引物序列及PCR扩增方法见表2。DNA样品保存于-20 ℃冰箱。
　　2.2 PCR引物设计与特异性筛选 在NCBI（National Center for Biotechnology Information，美国国立生物技术信息中心）下载到太子参及其伪品物种的rDNA-ITS序列，ClustalX2.1软件进行排序、比对、分析，找出具有稳定差异的特异性片段。运用Premier Primer 5.0软件针对太子参的特异性片段设计了3对鉴别引物，分别命名为Tzs-1F/Tzs-1R，Tzs-2F/Tzs-2R，Tzs-3F/Tzs-3R，序列见表2。各引物由上海生工生物科技有限公司合成。

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