UPLC法测定马甲子药材中马甲子素和messagenic,acid,B

　　摘 要：建立UPLC同时测定马甲子药材中马甲子素和messagenic acid B 2种抗肿瘤活性成分的方法。采用Waters ACQUITY UPLC BEH-C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）色谱柱，乙腈-0.1%甲酸溶液流动相梯度洗脱；流量：0.45 mL/min；柱温30 ℃；检测波长320 nm。结果表明：马甲子素和messagenic acid B分别在0.198 6～3.972 μg，0.151 4～3.028 μg范围进样量与峰面积呈现良好的线性关系，平均加标回收率分别为99.20%（RSD=1.34%）和99.69%（RSD=0.56%）。该方法能在3.5 min内使马甲子素和messagenic acid B最大程度地分离，相比较HPLC而言，更加快捷、高效。
　　关键词： 马甲子；messagenic acid B；超高效液相色谱；抗肿瘤活性
　　文献标志码：A 文章编号：1674-5124（2017）04-0048-04
　　0 引 言
　　马甲子（Paliurus ramosissimus（Lour.）Poir）为鼠李科马甲子属植物，主要含有三萜类、总黄酮和环肽生物碱等成分，具有治疗疮痈溃疡，解毒消肿的功效[1]。本课题组经前期实验研究，从马甲子叶中分离出一种新型的五环三萜类化合物，结构鉴定并命名为马甲子素。体外细胞实验显示，相比于马甲子叶中抗肿瘤活性成分白桦脂酸[2-3]，马甲子素的抗肿瘤活性更强[4]。单独的马甲子素含量的HPLC测定方法已见报道[5-6]。通过对马甲子化学成分的进一步研究，从马甲子叶中首次分离出一种化合物单体，经鉴定为已知化合物messagenic acid B[7-8]，与马甲子素僅存在单双取代基的差异，均属于以白桦脂酸为母核的五环三萜类衍生物，体外细胞实验也表现出较好的抗肿瘤活性[9]。本文通过建立超高效液相色谱（UPLC）含量测定方法[10]，在10 min内完成一次马甲子样品分析。此方法分离度好，重复性高，能同时测定马甲子药材中两种活性成分，可较为全面地控制有效成分的含量，为马甲子药材的质量控制和合理种植、采收提供科学依据。
　　1 实验部分
　　1.1 仪器和试药
　　Waters ACQUITY超高效液相色谱，包括四元高压梯度泵、自动进样恒温样品管理器、柱温箱、二极管阵列检测器、Empower 3色谱工作站。
　　乙腈（色谱纯，美国Sigma）；超纯水；甲酸、甲醇均为分析纯（成都艾科达化学试剂有限公司）。
　　马甲子素对照品和messagenic acid B对照品（成都普思生物科技股份有限公司，经峰面积归一法计算，纯度均大于98%）；马甲子鲜叶采于四川省成都市新津牧马山，经四川省中医药科学院鉴定为鼠李科马甲子属多年生木本植物马甲子Paliurus ramosissmus（Lour.）Poir。
　　1.2 方法与结果
　　1.2.1 样品的配置
　　分别精密称取马甲子素和messagenic acid B对照品1.986 mg、1.514 mg，用甲醇超声溶解并定容至10 mL，即得各自对照品溶液。精密吸取各自对照品溶液2.5 mL至10 mL容量瓶，用甲醇定容至刻度，混合均匀，作混合对照品溶液。
　　精密称取经冷冻干燥后的马甲子叶粉末5.0 g（过4号筛），置具塞三角瓶中，精密加入95%乙醇50 mL，称定质量，80 ℃加热回流提取3 h，取出冷却后，补足减失质量，摇匀过滤，取续滤液作为供试品溶液。
　　1.2.2 色谱条件
　　色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH-C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流动相A：乙腈；流动相B：0.1%甲酸溶液；梯度洗脱程序如表1所示，流量：0.45 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：320 nm；进样量：4 μL；混合对照品和马甲子供试品的色谱图分别见图1（a）和图1（b）。
　　1.2.3 线性关系
　　分别精密吸取马甲子素和messagenic acid B对照品溶液，按1，2，4，8，15，20 μL的进样量，以1.2.2色谱条件进行检测。以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，绘制标准曲线（见图2），分别计算线性回归方程：y（马甲子素）=8×106x+36 725（r2=0.999 8）；y（messagenic acid B）=9×106x+51 485（r2=0.999 9）。表明马甲子素对照品和messagenic acid B对照品分别在0.198 6～3.972 μg，0.151 4～3.028 μg范围内与峰面积呈现良好的线性关系。
　　1.2.4 精密度试验
　　精密吸取混合对照品溶液4 μL，连续进样5次，测定马甲子素和messagenic acid B峰面积的RSD分别为1.48%和1.35%，表明仪器精密度较好，具体数据如表2所示。
　　1.2.5 重复性试验
　　精密称取同一批次的马甲子叶粉末5份（过4号筛），按1.2.1方法制得供试品溶液，进样4 μL，测定马甲子素和messagenic acid B的含量，其RSD分别为1.93%和0.93%，表明本方法具有较好的重复性，具体数据如表3所示。
　　1.2.6 稳定性试验
　　精密称取等量同一批次的马甲子叶粉末（过4号筛），按1.2.1方法制得供试品溶液，分别在2，4，8，
　　10，12，24 h进样4 μL，测定马甲子素和messagenic acid B的含量，其RSD分别为0.87%和1.20%（如表4所示）。结果表明，供试品溶液在24 h内稳定。
　　1.2.7 加标回收率试验

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