茶叶样品中铬的液相色谱分析方法的研究

　　【摘 要】 采用微波灰化、固相萃取和高效液相色谱的方法对茶叶样品中的铬进行了测定分析。实验结果表明灰化过程通过程序升温的方法能得到良好的效果，在二苯卡巴肼溶液和磷酸溶液中，铬能和显色剂形成稳定的络合物，此络合物可被Sep-Pak C18的小柱吸附富集，使用5mL～10mL丙酮可完全洗脱，富集倍数可达到10倍。洗脱的样品在Eclipse XDB-C18（5μm，4.6×150mm）柱上，以丙酮和磷酸盐缓冲溶液为淋洗液，检测波长为543nm下分离测定，样品中铬的检出线可达到2ng。实验表明此方法在茶叶样品的测定中能得到良好的效果。
　　【关键词】 科技创新 技术标准
　　近几年来，全国市场上屡次出现用铅铬绿染色过的假冒伪劣茶叶，用这种颜料只要很少的分量，就可以让茶叶变色。但样品按传统合成色素的检测方法无法检出。国内对铅铬绿的检测研究报道也很少。由于铁蓝在铅铬绿中的比例无法确定（5%～45%不等），因此可以铅铬绿中的铅铬黄含量的高低表征铅铬绿含量的高低，即试样中铅铬绿的含量可以铅铬黄计。由于直接测定铬酸铅含量的难度很大，可通过测定样品中的铅、铬来间接测定。从已知文献中可知茶叶中一般都含有铅，比铬的含量要高，因此铬含量是样品中比较敏感的物质。若铬含量低于已知茶叶样品的本底值，则可以肯定试样中不含铬酸铅，也就不含铅铬绿；如试样中检出超过本底值最高铬含量，试样中可能添加了铅铬绿。目前国内外六价铬检测的标准方法均采用分光光度法，二苯碳酰二肼发生氧化还原反应产生的物质能生成稳定的紫红色络合物。由于该体系稳定，干扰少，显色反应选择性高，大多数的离子干扰都不大。由于茶叶中铬的本底浓度低，基体干扰大，通常需要事先进行富集才能达到满意的效果。进入20世纪80年代，将HPLC与分光光度法联用，突破了灵敏度和选择性难以统一的矛盾，形成了高效液相色谱光度法，在无机痕量分析中有了广泛的应用。因而本试验采用固相萃取分离富集技术和高效液相色谱法提出了一种方便、快速地分析茶叶样品中铬的分析方法。不仅可消除各种干扰，而且还大大提高检测灵敏度。
　　1 试验部分
　　1.1主要仪器和试剂
　　Cr标准储备溶液：100mg/L；Cr标准工作溶液：1.0mg/L，吸取一定量的Cr标准储备液，用水稀释而成；二苯碳酰二肼溶液：2.5g/L；70%磷酸溶液；丙酮；pH2.5 10mmol磷酸氢二钾；试验用水为高纯水。
　　液相色谱：Agilent technoligies 1000 series；固相萃取装置：agela负压16通道；微波灰化炉：CEM Phoenix Standard Unit。
　　1.2试验方法
　　（1）样品前处理
　　称取研磨的茶叶粉末10g左右（精确到0.001g）于50ml瓷坩埚中，在电炉上低温碳化（110℃～130℃）后，置于灰化炉中，10℃/min逐步升温，至500℃，并保持在500℃下干灰化处理1h，后以20℃/min升温至800℃，保持2h，至样品完全灰化，呈灰白色为止。试剂空白同时操作。灰渣在冷却后用少量蒸馏水湿润，再加入2mol/L盐酸，在电炉上低温溶解（如无法完全溶解的可加入几滴30%过氧化氢溶液），然后用蒸馏水定容10mL容量瓶中，待测，同时做试剂空白[8]。
　　（2）柱前衍生
　　移取1mL待测液于50mL容量瓶中，加入蒸馏水大约30mL，再加入1mL二苯卡巴肼溶液及1mL磷酸溶液，最后用蒸馏水稀释到刻度，混匀。静止20分钟后进行测定。
　　（3）固相萃取富集
　　衍生后的溶液以2.0mL/min速度通过Sep-PakC18柱。用5mL～10mL丙酮溶液洗脱吸附在柱上的二苯偶氮碳酰肼的络合物，后以丙酮定容至10mL。
　　（4）色谱测定
　　（5）色谱条件和参数表
　　表1 色谱条件和参数
　　按照上述色谱条件下的色谱图见图1，图中6.39分钟的峰为铬的衍生产生物的色谱峰。
　　图1 衍生后色谱图
　　2 结果与讨论
　　2.1工作曲线及检出限
　　配置一系列不同浓度的六价铬标准溶液，按1.2.2测定。将色谱峰面积（或峰高）对六价铬浓度作图2，得到标准曲线。
　　表2 标准工作曲线
　　图2 标准工作曲线 图3 标准工作曲线
　　由图2和图3可得到标准曲线方程为：
　　H=0.6259×C+0.3759 复相关系数为0.9993
　　A=14.962×C+11.152 复相关系数为0.997
　　从图表和回归分析可以看出，无论使用峰面积还是峰高对浓度进行回归都可以得到良好的线性关系。
　　高效液相色谱法测定茶叶中的六价铬，灵敏度较高，检测低限为0.2μg/50mL，相当于2mg/Kg样品。从资料和文献来看，大部分的茶叶样品中的铬的本底值基本上都小于2mg/Kg，因此为了测定的准确性，要进行样品的浓缩富集处理。
　　2.2固相萃取富集条件
　　Sep-PakC18固相萃取小柱为反相柱，小柱对无机离子与试剂生成的络合物的萃取可用疏水缔合原理解释，二苯碳酰二肼与Cr生成的络合物具有一定的疏水性，以水溶液通过小柱时能富集在柱上，改用少量溶剂强度大的溶剂（乙醇、乙腈、丙酮等）洗脱就能把络合物洗下而达到富集目的。
　　试验表明，用5mL的丙酮以2.0mL/min的流速可把小柱上富集的络合物和试剂能完全洗下，因此试验选用10mL的丙酮洗脱至10mL容量瓶中，用丙酮定容，以相应的试剂空白做参比，液相色谱进行测定。
　　2.3稳定性和重现性
　　目标络合物的稳定性以及在色谱过程分析中的重现性对测定数据的准确性至关重要。因此将一个标准溶液按上述方法进行测定，并相隔一定时间后重复进样，结果见表3。由表3可以看出：在10小时以内，目标化合物很稳定，方法重现性好。
　　表3 衍生物的稳定性
　　把吸附有Cr-二苯偶氮碳酰肼络合物的Sep-PakC18放置于避光处，在室温下，分别在10min、1h、2h测定有色络合物的吸光度和色谱分析，结果表明，吸附在Sep-PakC18上的有色络合物在2h内能够保持稳定。从SPE-PakC18柱上洗脱下来的样品的色谱图，见图4。由图可见衍生物能很好的被富集，其他的组分基本上保持原来的峰高，没有太大的变化。
　　图4 富集后样品色谱图
　　2.4干扰消除
　　因此采用高效液相色谱法测定茶叶中的六价铬，以二苯基碳酰二肼作为衍生剂，选择性高，Cu2+、Zn2+、Cr3+、Al3+等金属离子的干扰都不大。Fe3+虽可与二苯基碳酰二肼作用成黄棕色络合物，但在样品分离分析过程中采用磷酸氢二钾作缓冲溶液，Fe3+与PO43-生成稳定的无色络合物，从而消除了Fe3+的干扰。在对样品进行柱前衍生后，不同组分经色谱柱分离后，按流出的顺序先后到达检测器。只要检测条件合适，不同组分能有效分离，则各种干扰就可消除。
　　2.5实际样品分析
　　图5 含美术绿绿茶衍生色谱图
　　由图5可见实际样品测定中的复杂成分基本上对测定没有什么干扰。
　　由于铅铬绿属于茶叶中禁止添加的物质，故在进行回收率试验时选择了方法测定低限及使茶叶呈不同程度绿色的三个浓度水平的铬酸铅进行添加，结果见表4。从实验数据看，方法的回收率、精密度试验结果满足测定要求。
　　3 结论
　　●样品前处理方法，采用灰化方法，能够很好地消解样品；
　　●使用二苯碳酰二肼作为螯合剂，具有良好的络合效果和选择性，同时具有良好的稳定性，能满足测定的要求；
　　●本研究选用博纳艾杰尔Cleanert ODS C18（封端）为固相萃取柱，能够很好地富集衍生产物，同时能对样品有很好的净化作用；
　　●衍生物具有良好的稳定性；
　　●实验结果表明通过固相萃取和高效液相色谱能很好地消除样品中的干扰；
　　●在高效液相色谱上采用丙酮和磷酸氢二钠和磷酸缓冲溶液为流动相，采取梯度淋洗的方法能得到满意的分析效果。

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