趋磁真菌研究进展_真菌果胶酶的研究进展

　　收稿日期：2006-09-22? 　　作者简介：黄娟（1981-），女，湖南益阳人，武汉科技大学中南分校生命科学学院教师。? 　　（武汉科技大学中南分校 生命科学院，湖北 武汉 430223）?
　　摘要：果胶酶作为植物病原真菌的重要致病因素之一，近年来研究进展较为迅速。本文阐述了果胶酶的分类、结构、功能、表达、以及基因调控，同时对果胶酶在植物病程中的作用也进行了介绍。?
　　关键词：果胶酶；表达；基因调控?
　　中图分类号：Q55 文献标识码：A??
　　
　　自1966年Bateman和Millar研究了果胶酶在植物细胞壁降解中的作用[3，4]，迄今对果胶酶在各方面的研究进展十分迅速[4]。许多学者利用层析，电泳，放射免疫化学等现代科技手段对果胶酶的生物化学进行了广泛的研究，明确了一些病原菌果胶酶的氨基酸组成，分子量，同工酶数量及酶动力学[1，2，3，5]，在遗传学方面，某些果胶酶的编码基因已得到克隆，通过质粒建立了相应的克隆基因库，研究了某些果胶酶编码基因的同源性[4]。在植物病理学方面，为了探索果胶酶在植物病程中的作用，从生理及超微结构上研究了罹病组织内果胶酶的活性；许多学者探讨了在寄主和寄生物自然变异条件下罹病组织内病菌致病性和果胶酶活性之间的相互关系，利用果胶酶进行了病害症状复制，并对果胶酶缺陷型突变株致病性表现型进行了系统的观察、分析，初步证实了高度纯化的果胶酶可以浸解植物细胞壁，病原菌果胶酶的产生及调控与植物发病并非是简单的相互关系。?
　　
　　一、果胶酶的分类及酶的动力学研究?
　　
　　（一）果胶酶的种类?
　　根据酶所催化的反应类型，果胶酶分为水解酶和转消裂解酶两大类。果胶水解酶类已知有6种，如内聚半乳糖醛酸酶（endo-PG），果胶甲酯酶（PME或PE）；转消裂解酶类已知有4种，如内果胶甲基转消酶（endoPMTE）或果胶裂解酶（PNL）、内聚半乳糖醛酸转消酶（endoPGTE）或果胶酸裂解酶（PL）。果胶酶一般都有两种形式endo-和exo-，endo-的形式比exo-的形式更有效，因为endo-形式的酶可以以随机方式作用于底物的a-1，4糖苷键的任何部位，生成各种寡聚体的混合物，而exo-形式的酶仅作用于非还原性末端糖苷键，生成定量的二聚体，所以在罹病植物中endo-形式的果胶酶多于exo-形式。?
　　1.多聚半乳糖醛酸酶（PG）?
　　曲霉菌ＰＧ最初（1990）从商品的黑曲霉（A.niger）果胶酶分离到5种endoPG 1种exoPG。主要的endoPG为endoPGⅠ和endoPGⅡ，分子量分别为55kDa和38kDa，两者的等电点、比活、对寡聚底物的作用方式及氨基酸组成全然不同。另外3种endoPG即endoPGⅢA，endoPGⅢB和endoPGⅢC的生理活性与endoPGⅠ极相似。其后从黑曲霉基因组文库分离出几个基因，编码的endoPGE分子量35.6kDa，pI=3.6，最适pH=3.8。endoPGE与endoPGC的AA序列同源性最高，有77.6%相同，与endoPGⅠ和endoPGⅡ的同源性较差，分别为57.6%和54.3%相同[6]。米曲霉（A.oryzae）有2种PG，分子量分别为41kDa和39kDa，最适pH为5.0，最适温度分别为45℃和55℃[7]。黄曲霉（A.flavus）两个PG基因即pecA和pecB，前体蛋白预期分子量分别为37.6kDa和38kDa[8]。其它曲霉菌，如 A.ustus的endoPG分子量为36kDa，pI=8.3。A.parasiticus的endoPG基因pecA用黑曲霉pgaⅡ做探针分离到，与其它真菌的PG基因极相似。A.tubigensis的endoPG基因pgaⅡ与 A.niger的pgaⅡ基因的核苷酸序列有83%相同，前体蛋白AA序列94%相同。?
　　灰霉菌（Botrytiscinerea）PG最初从在苹果果胶上培养的灰霉菌分离得到5种PG同工酶（Ⅰ―Ⅴ），4个酸性，1个碱性，pI分别为9.3、4.9、4.6、3.7、2.7，其中以PGⅢ比活最高，PGⅠ为内切酶，另4种为外切酶。后来从灰霉菌引起的苹果腐败组织中分离到1种exoPG，表观分子量为45kDa，pI=4.6，与此菌在液培时产生的同工酶的pI、最适pH和作用方式相似。另用A.niger的pgaⅡ基因做探针从灰霉菌分离到6个endoPG的编码基因，这6个基因编码的endoPG前体的氨基酸序列有34―73%相同，可分到3个单源（monophyletic）组中[9]。?
　　镰孢菌（Fusariumspp.）的PG番茄尖镰孢（Fusariumoxysporumf.sp.lycopersici）一种主要胞外endoPG前体蛋白分子量41.1kDa，成熟蛋白推算分子量为35.5kDa，pI=6.2，与F.moniliforme的PG，C.carbonum的PGN1，Ａ.niger的PG，Ａ.oryzae的PG，和S.sclerotiorum的PG1分别有82.9%、29%、27.6%、14.2%和26.9%同源性[10]。?
　　番茄根腐尖镰孢（F.oxysporumf.sp.radicis.lyc-opersici）在降解果胶时先产生endoPG，以后以exoPG为主。exoPG与其它真菌的endoPG相似程度高[11]。串珠镰孢（F.moniliforme）也有一种endoPG。?
　　其它真菌的PG菜豆炭疽病菌（Clletotrichumlindermuthianum）已有2个endoPG基因被克隆，其中pg1编码主要的endoPG，这个基因在病菌腐生时和在侵染植物时都表达。在菜豆坏死组织中检测到，与细胞壁大量降解有关，RT-PCR表明在侵染的死体营养阶段开始时pg1表达。pg2与pg1AA序列有61%相同，与其它真菌的endoPG有37%-59%相同[12]。?
　　核盘菌（Sclerotinia sclertiorum）的endoPG有多种等电点不同的同工酶，其中pg1是一种中性蛋白，endoPG2和endoPG3的等电点分别为4.8和4.9，分子量相似，氨基酸组成上仅在天冬氨酸，天冬酰胺组成上不同，与PG1氨基酸序列分别有90%和89%相同。用PG3制备的抗体与PG2有交互反应，但不与黑曲霉PG反应。endoPG由多基因家族编码，7个基因构成这个家族的2个亚家族。比较这个基因家族的3个成员的编码区的核苷酸序列，发现差异很小[13]。北方核盘菌（S.borealis）有1种特殊的喜冷endoPG，分子量为40kDa，等电点为7.5，最适pH为4.5，适温为40―50℃，在5℃仍有30%的活性，60℃时活性弱[14]。?
　　玉米圆斑病菌（Coboluscarbonum）的1个endoPG基因pgn1和1个exoPG基因pgx1已分离到，pgx1产物PGX1前体推算分子量为48kDa，与A.tubingensis的exoPG有61%氨基酸相同。Pgx1突变菌系在果胶上生长慢，对玉米仍致病，pgn1/pgx1双突变菌系尽管PG活性只及野生型1%，但仍对玉米致病[15]。青霉菌P.oxalicum有2种PG，PGⅠ不太稳定，为外切酶，PGⅡ为内切酶，活性强，4小时内可浸解和杀死木薯组织，在病程中似起主要作用。P.janthnillum和P.griseoroseum各有1种PG[16]。啤酒酵母（Scchato mycescerevisiae）CECT1389菌系一种endoPG表观分子量39kDa，最适pH为5.5，最适温度为45℃。啤酒酵母PG与其它真菌的PG有54%同源。与植物和细菌的PG只有24%同源。每个单倍体只有1个单基因拷贝[17]。?
　　脉孢菌（Neurosporacrassa）的endoPG洗脱成单一活性峰，提纯的PG为单体糖蛋白（38%CH2O），表观分子量36.6～37.0kDa，最适pH6.0，最适温度45℃[18]。栗疫菌（Cryphonectri aparasitica）的成熟蛋白ENPG-1推定分子量为34.5kDa，pI=7.2，与玉米圆斑病菌的endoPG有66%相同[19]。榆枯萎病菌（Ophiostromanovoulmi）也有一种PG。?
　　2.果胶裂解酶（PL）?
　　果胶裂解酶（PL）主要是曲霉菌和镰孢菌产生PL，此外还有P.oxalicum和啤酒酵母和灰霉菌。从黑曲霉已克隆到6个PL编码基因，即pelA、pelB、pelC、pelD、pelE和pelF，其中pelA和pelD分别编码商品果胶酶Ultram的两种主要PL即PLⅠ和PLⅡ。从茄镰孢豌豆专化型（F.solanif.sp.pisi）分离到4个endoPL基因，即pelA、pelB、pelC、pelD[20]。pelA编码的endoPLA前体蛋白29kDa，成熟蛋白26kDa，pI=8.3，最适pH=9.4。pelB编码的PLB分子量为25.6kDa，最适pH值10.0。与PLA的AA序列有65%相同，PLA和PLB与其它果胶酶无明显的同源性。PecC编码的PLC分子量23.3kDa，与PLA有血清关系，AA序列与有51%相同，最适pH9.5，活温55℃。pelD编码的PLD分子量24.5kDa，成熟蛋白分子量22.7kDa，AA序列与PLA、PLB、PLC分别有49%、44%、65%相同。?
　　番茄尖镰孢编码PL1的基因与茄镰孢豌豆专化型（F.solanif.sp.pisi）的pelA、pelB、pelC、pelD基因分别有89%、67%、55%和56%同[21]。?
　　3.果胶酯酶（PE）?
　　黑曲霉、啤酒酵母和玉米圆斑病菌等菌具有PE，PE去酯化是随机的。?
　　（二）果胶酶动力学的研究?
　　酶动力学的研究目前集中于endoPG，PME（PE）及其同工酶方面，不同种病菌分离自同一种果胶酶在分子量，最适pH值，pI，氨基酸组成，Km等方面均有所差异，即使从同一种病菌分离的同一种果胶酶，也因实验条件的不同而不完全一致。一般而言，除PME外，其它果胶水解酶的最适pH值均在4.0―5.0之间，pI偏低，在6.0―8.0之间，而转消裂解酶最适pH值在9.0―9.5之间，pI在8.0―9.0之间，并且容易被二价阳离子激活[5，22]。果胶酶的最适pH值比较稳定，这是分离提纯两大类果胶酶的依据之一。一般果胶酶的最适温度均在40―53℃。细菌果胶酶复合体中，PL有各种同工酶，pI分别为碱性，酸性，中性[23]；真菌果胶酶复合体中，水解酶有同工酶，如从Botrytis cinerea等真菌分离到的endoPGI，Ⅱ[5、22]。PLb和PLc，PEI和PEⅡ和酶学特性相似，可能是由重复基因编码所致。Botrytiscinerea的PG和PE符合米氏方程，谷氨酸为PG的竞争性抑制因子。Km和Vmax受盐浓度影响。?
　　
　　二、真菌果胶酶的结构与功能?
　　
　　真菌果胶酶基因的开放读码框（ORF）绝大多数被内含子分隔。内含子最多的达7个，两种已克隆的PE基因都有6个内含子。?
　　果胶酶的前体蛋白Ｎ信号肽一般为16～27AA，个别如曲霉菌的PGC有一个较长的N信号肽（40AA），有的PL无N信号肽。?
　　许多果胶酶都有糖基化位点，如串珠镰孢endoPG前体有4个糖基化位点。关于酶的活性中心，对24种曲霉PG的分析表明，一个外露的Tyr残基在pH9.3～9.5时离子化，可能与催化有关，内藏的Tyr残基与催化关系密切，在pH10.5时离子化[24]。串珠镰孢endoPG的His234对酶活性和浸解活性起关键作用，与结合PG1P无关，当His234→Lys时无酶活，Ser237和Ser240→Gly时，酶活性分别降低48%和6%。?
　　
　　三、表达与调控?
　　
　　如前所述，多种真菌的果胶酶已在酵母菌中正确表达。如茄镰孢豌豆专化型pelB、pelC、和pelD的cDNA转入一种毕氏酵母（Pichiapastoris）可表达。果胶酶一般受果胶、植物维管组织、低浓度的（0.1%）Ｄ半乳糖醛酸、半乳糖诱导，受葡萄糖、较高浓度（1%）的半乳糖醛酸、抗体、某些抗菌素（如阿莫西林）、植物的PG抑制蛋白（PGIP）抑制。Ca2+抑制一些PG，而一些PL的活性需Ca2+参与个别果胶酶基因组成型表达。?
　　
　　四、真菌果胶分解酶的加工和输出?
　　
　　真菌果胶酶一般有糖基化位点，功能酶以糖蛋白形式存在。如玉米圆斑病菌pgx1N端有12AA的糖基化位点，糖蛋白分子量60kDa，去糖基后表观分子量45kDa[15]。核盘菌在多聚半乳糖醛酸的培养基上培养的早期分泌的2种endoPG都是糖蛋白。番茄根腐尖镰孢exoPG的糖基化程度高，糖蛋白形式存在时分子量为66kDa，去糖后50kDa[11]。不过以黑曲霉的endoPC糖基化程度最高。?
　　果胶酶一般输出到胞外，如啤酒酵母的endoPG。?
　　
　　五、果胶酶在植物病程中的作用?
　　
　　果胶酶在植物中的作用是复杂的，它虽然可以由许多微生物产生。然而，一些微生物即使能在离体条件下产生，但在自然条件下的植物体内却不一定产生。因此能产生果胶酶的微生物不一定就是病原物。要确定在自然生态条件下果胶酶的作用，必须了解果胶酶产生系统内的选择压力，而实现这一目标的重要手段就是在其它的寄主和环境下，探索产生果胶酶的突变株的各种表现型。?
　　在有些病害中，果胶酶的活性与致病性呈正相关，但也有不少事实证明果胶酶的活性与致病性无关，所以有人提出果胶酶可能是在病程中，病害复合体的诸因素之一，也就是说病菌的致病性可能还有其它必要的基因控制，也有人认为果胶代谢在植物病程中不是必须的，果胶酶的诱导产生只是对植物内部效应因子的反应。总之，对于果胶代谢在植物病程中的作用有待进一步探索。有些病菌（尤其是真菌）尽管在不同的植物细胞壁上生长速度不同，但这种生长速度的差异与果胶酶的产生或寄主一寄生物相互亲合性无关。因而每种病菌与寄主的关系不能简单化和通用化。?
　　
　　六、结 语?
　　
　　真菌果胶酶的多样性使我们在利用果胶酶时有了更大的选择余地。对于一些产果胶酶也产致癌毒素如黄曲霉素的真菌，可将其果胶酶基因转入不产毒素的真菌如酵母菌和米曲霉中。为得到单一的果胶酶，可将其基因克隆到不产果胶酶的相近真菌中。用强启动子如TEF1α启动子取代果胶酶基因原有的启动子或在果胶酶的发酵生产中加入果胶酶诱导物可用以提高产量，而在果实贮藏期间可用果胶酶抑制物处理或转PGIP基因入植物可防软化。富含果胶的物质如苹果渣既是果胶酶诱导物和底物，也是果胶酶的良好载体。北方核盘菌喜冷endoPG的发现为果胶物质的低温降解提供了可能。在许多重要植物病害中，果胶酶是重要的致病因素之一。真菌果胶酶的进一步研究将有助于更合理地利用果胶酶。?
　　
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