12种藏医常用药材抗结核分枝杆菌活性筛选

　　摘要：目的 观察12种藏医常用药材对结核分枝杆菌标准菌株H37Rv的体外抗菌活性。方法 取适量的12种藏医常用药材制备其水及/或乙醇粗提物，比例法检测各粗提物对结核分枝杆菌H37Rv菌株的抗菌MIC。结果 试验药材中红花的水及乙醇粗提物MIC分别为5.86 mg/ml和0.74mg/ml，对H37Rv抗菌活性最强。唐古特青兰、藏垫雪灵芝和短穗兔耳草的水提取物具有较明显的抗菌活性，MIC分别为18.75mg/ml、18.75mg/ml和46.88mg/ml。其他各药材抗菌活性较弱，其MIC均大于50mg/ml。结论 所试12种藏医常用药材中红花、唐古特青兰、雪灵芝和短穗兔耳草均具有不同程度的体外抗结核分枝杆菌活性。
　　关键词：结核分枝杆菌；藏药；药物敏感性试验
　　结核病是由结核分枝杆菌引起的传染病，由于耐药及耐多药结核分枝杆菌（multidrug resistant tuberculosis，MDR-TB）的出现， 结核病合并HIV感染以及人群流动性增加等原因， 结核病在全球的流行再次呈现上升态势[1]。自上世纪四十年代第一个抗结核分枝杆菌药物-链霉素及其后的异烟肼、利福平等药物应用于临床以来， 虽然人们已研发出近20种抗结核分枝杆菌的药物， 但均存在副作用大， 易产生耐药性等缺点[2]，而且新药物的研发远不及细菌耐药性形成的速度。因此，从丰富的传统中药资源中寻找有效的抗结核药物，受到人们越来越多的重视。
　　为了寻找具有明显抗结核分枝杆菌的天然药物用于临床结核病的治疗，本研究对12种藏医常用药材进行了体外抗结核分枝杆菌H37RV菌株的药物敏感性试验，现将初步筛选结果报告如下：
　　1资料与方法
　　1.1 一般资料 结核分枝杆菌标准菌株H37Rv（ATCC27294），国家疾病预防控制中心惠赠，西藏大学医学院病原生物学实验室真空冷冻保存。
　　1.2试验药材 试验用藏药材样品产地、来源、鉴定人、药用部位及提取溶媒见表1。
　　1.3培养基 改良罗氏培养基。制备方法参考"结核病诊断细菌学检验规程"进行[3]。
　　1.4实验方法
　　1.4.1试验样品的制备 称取各药材粗粉适量，1：10加入1000ml纯水或乙醇，室温下浸泡24h，60～70℃回流提取3次，2h/次，滤除药渣，合并滤液，滤液60～70℃旋转蒸发浓缩至适当体积或浸膏，部分药物浸膏以真空冷冻干燥至粉末。不同样品提取用溶剂见表1。取各药物提取物适量，以灭菌0.5%吐温-80生理盐水溶解即为试验药物原液，-80℃存放备用。部分提取物加入适量吐温-80助溶。试验药物原液使用时以灭菌0.5%吐温-80生理盐水2倍稀释成若干稀释度使用。
　　1.4.2藏药培养基的制备 基础培养基仍采用改良罗氏培养基， 改良罗氏培养基中的水分以试验药物原液及稀释液代替， 孔雀绿溶液的配制、全卵液的匀化、培养基的凝固及保存等同改良罗氏培养基的制备。
　　1.4.3菌悬液制备 刮取改良罗氏培养基表面生长2w之结核分枝杆菌H37RV培养物（需刮取斜面各个部分的培养物）置于磨菌器底部，使用磨菌棒研磨使呈乳酪状，以灭菌0.5%吐温-80生理盐水稀释，与1号标准麦氏比浊管比浊，即配成1mg/ml的菌悬液。
　　1.4.4接种与培养 将1mg/ml的菌悬液10倍稀释至10-2mg/ml。以灭菌吸管准确吸取菌液0.1ml分别接种于含药培养基及对照培养基斜面上，每管接种菌量为10-3mg。置37℃培养，4w后观察结果。待空白对照管菌落生长至培养基斜面1/3以上时终止培养，对照培养基菌落在200以下者不纳入研究范围。
　　1.4.5计算耐药百分比 （含药培养基表面生长菌落数/对照培养基表面生长菌落数）×100%， 若耐药百分比小于1%， 则认为受试菌对该浓度药物敏感，反之则为不敏感。
　　2结果
　　12种试验药物水和/或乙醇粗提物对结核分枝杆菌的最低抑制浓度（ minimal inhibitory concentration， MIC ）结果见表1。结果表明，12种试验药材中红花的水和乙醇粗提物MIC分别为5.86mg/ml和0.74mg/ml，对H37Rv的抗菌活性最强，且80%乙醇粗提物活性优于水提取物。其次，具有较明显抗菌活性的依次为唐古特青兰、藏垫雪灵芝和短穗兔耳草的水提取物，其MIC分别为18.75mg/ml、18.75mg/ml和46.88mg/ml。其他各药活性较弱，其MIC均大于50 mg/ml，其中螃蟹甲和乌双龙胆在试验药物的第一个稀释度即无抗菌活性。
　　3讨论
　　我国传统中医药对结核病的治疗已有2000余年的历史。藏医药是我国民族医药的一枝奇葩，不仅对疾病具有独特的认识和用药习惯，而且由于西藏地处青藏高原，常年高寒缺氧、紫外线辐射强，日照充足、空气干燥，这些独特的生境可能促使藏医药用植物产生具有更高药理活性的成分，甚至独有的药理活性成分。
　　本实验尝试从藏医临床常用药材中初步筛选体外具有抗结核分枝杆菌活性的藏医用药物。实验结果显示在所选试验药物中大部分具有不同程度的体外抗菌活性，其中尤以红花作用最为明显，此与宋玉宗等[4]的报道相一致，但其作用稍弱，其可能原因为我们实验所采用的方法为绝对浓度法，而其为液体稀释法，前者不及后者对药物浓度的测试精准。
　　唐古特青兰、藏垫雪灵芝、短穗兔耳草均为藏医常用药材，有研究显示三者均具有一定的体外抗菌活性。短穗兔耳草主要用于发热、肾炎、肺病、引道流黄黑色液物等疾病[5]，张忠以及杨云裳[6]研究显示其粗提物对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草杆菌及荧光假单胞菌都有抑菌活性，MIC最低可达0.05g/ml；雪灵芝是一种重要的民间草药， 常用于治疗感冒、肺炎、黄疸、风湿症、淋巴结核、肾结石、子宫病等[7]，鲍敏等[8]采用滤纸片扩散法测试雪灵芝的水及乙醇提取物对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、梭状杆菌等均有不同程度的抑制作用。另外，也有研究提示唐古特青兰亦具有一定的抗菌活性[9]。但有关这三种常用药材抗结核分枝杆菌的情况则未见报道。在本实验中三者的水提取物均表现有较好的抗菌活性。虽然紫金标、草木犀[10，11]等其余药材也有文献显示具有抗菌活性，但在本实验中显示的抗菌活性均较低。

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