快速PCR方法在蛇类药材真伪鉴别中的应用

　　[摘要]为优化获得一种准确、快速、高效鉴别药典所载蛇类药材（乌梢蛇，金钱白花蛇，蕲蛇）真伪品的方法。该研究以蛇类药材经典PCR鉴定方法为基础，采用碱裂解法提取基因组总DNA，加入特异性PCR引物，采用两步法进行PCR扩增，从而对蛇类药材及其混淆品进行鉴别。通过对影响PCR反应时间的退火温度、变性温度、退火时间、变性时间、循环次数等因素进行优化，并对不同型号PCR仪和Taq酶进行考察，分别获得乌梢蛇、金钱白花蛇、蕲蛇快速PCR反应程序。在PCR产物中加入SYBR Green I染料，正品显示出明亮绿色荧光，而混淆品不显示荧光。所建立的蛇类药材快速PCR真伪检测方法可在30～45 min完成，为蛇类药材现场快速鉴定提供技术支持。
　　[关键词]快速PCR；蛇类中药材；分子鉴定；荧光检测
　　蛇类药材一直是动物药重要的组成部分，多具祛风、通络、止痉功效，临床应用较为广泛。《中国药典》2010年版中共收载了3种蛇类药材：乌梢蛇Zaocysd humnades，金钱白花蛇Bungarus multicinctus，蕲蛇Agkistrodon acutus。近年来，由于野生资源逐渐匮乏，加上价格昂贵，市场上出现蛇类伪品和混淆品甚多，且仅凭外部形态特征难以准确辨认^[1]。随着分子鉴定技术的引入，药典鉴别项下增加了乌梢蛇、蕲蛇的PCR鉴定，但由于药典所载方法用时较长，无法适应当前中药分子鉴定技术现场运用的需要^[2]。
　　PCR作为分子生物学中应用最广泛的技术之一，随着研究和应用领域的不断增长，存在着相当巨大的改进空间。自Millus等^[3]发明PCR技术以来，对PCR技术的改良从未停止过。Yap等^[4]通过调整PCR条件来缩短PCR反应时间。Wittwer等^[5-6]通过热空气注入法快速控温，从而减少升降温的时间，并提出了快速PCR（rapid PCR）的概念。
　　快速、准确、高通量鉴别是现代中药分子鉴别的核心需要，本文基于乌梢蛇、蕲蛇药典PCR鉴定方法和已建立的金钱白花蛇PCR鉴定方法^[7]，对这3种蛇类药材PCR鉴别技术的反应程序进行了优化，建立了快速PCR鉴别方法，并引入了荧光染料法对真伪鉴别结果进行检测，同时结合药材DNA快速提取技术^[8]，可将蛇类药材真伪鉴别时间控制在30 min左右，为实现药材分子鉴别的现场运用提供技术支撑。
　　1 材料
　　1.1 蛇类药材 选取来自于不同产地的11批乌梢蛇正品、12批金钱白花蛇正品、8批蕲蛇正品及其33批混伪品进行快速PCR研究。蛇类样品收集自广东、江西、北京、安徽等地区，由中国食品药品检定研究院中药标本馆张继研究员鉴定，凭证标本保存于中国中医科学院中药资源中心，见表1。
　　1.2 仪器 GeneAmp 9700型PCR扩增仪（Applied Biosystem公司）； TC-512梯度PCR仪（TECHNE公司）；VeritiTM 96孔梯度PCR扩增仪（Applied Biosystems公司）；5810 R 型高速冷冻离心机（Eppendorf公司）； VORTEX-2 GENIE漩涡震荡仪（Scientific industries 公司）；DYY-12 型电脑三恒多用电泳仪（北京六一仪器厂）； HE99X-15-1.5型电泳槽（Hoefer公司）；SYNGENE凝胶成像系统（GENE公司）； ZF-7A型手持式紫外灯（上海谷村电子光学仪器厂）。
　　1.3 试剂 琼脂糖购自Promega公司；溴化乙啶购自Fluka公司；rTaq DNA聚合酶、SpeedStar HS Taq DNA聚合酶、DL 2000 DNA Marker购自TaKaRa公司；AptaTaq fast DNA 聚合酶Mix购自Roche有限公司、Transfast Taq DNA聚合酶购自Transgen有限公司；10 000× SYBR Green I购自Invitrogen公司；其他试剂均为国产分析纯。
　　2 方法
　　2.1 基因组总DNA的提取 取20 mg蛇类药材粉末，使用碱裂解法^[8]提取总DNA，所提取DNA稀释10倍用于PCR反应。通用引物对Cytb-H /Cytb-L用于PCR反应以检测DNA质量，25 μL PCR反应体系，包含2.5 μL 10× buffer，1 μL 10 mmol·L^-1dNTPs，0.25 μmol·L^-1上游及下游引物、0.25 U SpeedStar HS Taq DNA聚合酶、1 μL 20% PVP 40溶液、0.5 μL 10 g·L^-1 BSA溶液、1 μL （约10 ng） DNA 模板，反应程序见表2。
　　2.2 PCR扩增条件的确定 取样品DNA用于确定快速PCR反应条件。25 μL PCR反应体系，包含2.5 μL 10× buffer，1 μL 10 mmol·L^-1dNTPs，0.25 μmol·L^-1上游及下游引物，0.25 U SpeedStar HS Taq DNA聚合酶、1 μL 20% PVP 40溶液、0.5 μL 10 g·L^-1 BSA溶液、1 μL（约10 ng）DNA 模板。PCR反应在GeneAmp 9700型PCR扩增仪上进行，初始反应程序见表2。反应结束后取PCR反应产物5 μL，加入2 μL 6× Loading buffer （Takara 公司） 混匀后于EB染色的1%琼脂糖凝胶电泳检测，SYNGENE凝胶成像系统观察、成像。
　　分别利用蛇类特异性鉴别引物对WuShao-F/WuShao-R，JinQian-F/JinQian-R，QiShe-F/QiShe-R进行PCR反应，并考察退火温度：61，63，65，67，69，71 ℃（乌梢蛇，蕲蛇）；60，62，64，66，68，70 ℃（金钱白花蛇）；PCR循环数：30，28，26，24，22个循环；变性温度：94，92，90，88，86，84 ℃；变性和退火时间：20，10，5，3，1 s；Taq酶种类：r Taq DNA聚合酶，SpeedStar HS Taq DNA聚合酶，AptaTaq fast DNA 聚合酶Mix，TransfastTaq DNA聚合酶；不同PCR仪：9700型PCR仪（ABI公司），VeritiTM 96孔梯度PCR扩增仪（Applied Biosystems公司），TC-512型PCR仪（TECHNE公司）。

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