微紫青霉果胶酶降解再造烟叶高浓混合浆中果胶的研究

　　摘要：为降低再造烟叶中的果胶含量，采用单因素试验和正交试验对微紫青霉产果胶酶降解果胶的工艺条件进行优化，分析了酶解前后样品的热裂解产物，并将酶解后样品抄造制丝添加至卷烟中进行感官评价，结果表明：微紫青霉产果胶酶降解果胶的最佳反应条件为酶活力3000 U/mL，高浓混合浆干重与粗酶液体积的料液比1GA6FA1，反应温度50 ℃，处理时间3 h.在此条件下果胶降解率达到最大，为28.63%，相对分子量由341 kDa减小到55 kDa.酶解后样品裂解产物的组成和含量发生明显变化，除醇类物质外，其他香味物质酚类、醛酮类、酯类、杂环类减少.将酶解后的样品抄造制丝添加于卷烟中，香气质丰满细腻，透发性、甜润感增强，刺激性减小，余味纯净舒适，吸食品质得以改善，但劲头略有不足.
　　关键词：微紫青霉;果胶酶;再造烟叶;果胶降解率
　　中图分类号：TS41文献标识码：ADOI：10.3969/j.issn.2096-1553.2019.01.004
　　文章编号：2096-1553（2019）01-0027-09
　　0 引言
　　果胶是构成烟草细胞壁的主要物质之一，在烟草中的含量约占5%～13%（若无特指，百分数均为质量分数），它是以半乳糖醛酸为主链，并连接着2-吡喃型鼠李糖基的复合多糖类物质[1-3].这类物质在热解时会产生甲醇，并进一步氧化为甲醛、甲酸等，这些氧化产物会增加烟草燃吸时的刺激性，对烟草的内在品质和安全性产生不利影响[4-6]，对人体有害.因此，适当降低烟叶中果胶的含量，对于提升烟叶品质、降低卷烟危害，具有重要的意义.
　　烟草果胶降解通常采用生物酶解方法.施林燕[7]通过对烟梗丝施加复合酶，使烟梗丝中的果胶含量降低13.08%.于建军等[8]研究发现，对烟叶施加果胶酶后会使烟草香气物质含量增加29.94%，可能是由于施加果胶酶后使烟叶中总糖含量增加所致.于兴伟等[9]采用固态发酵法用黑曲霉处理烟梗，发现烟草中果胶含量也明显降低.马东萍等[10]选用复合中性纤维素酶、酸性蛋白酶、复合果胶酶和中性脂肪酶配制成一种改性添加剂，这种改性添加剂可对烟梗中果胶、蛋白质等大分子化合物进行有效的生物降解和转化，从而改善萃取液中的致香物質.柏婷[11]利用生物酶解技术和化学技术对果胶进行降解.结果表明，当果胶酶质量分数为0.5%时，烟草中果胶含量由18.61%降低至 9.52%，且再造烟叶烟香较浓，刺激性明显下降，感官品质也得到明显改善.然而，利用微紫青霉生产果胶酶并将其应用于烟草果胶降解的报道则相对较少[12-14].鉴于此，本研究拟采用从烟田土壤中分离出的微紫青霉（Penicillium janthinellum）sw09菌株，根据该菌株高产果胶酶的特性，利用其粗酶液对造纸法再造烟叶混合浆料进行果胶降解处理，并进一步开展化学分析和感官质量评价，以期为烟叶品质提升和卷烟危害成分降低研究提供参考和借鉴.
　　1 材料与方法
　　1.1 材料、试剂与仪器
　　供试材料：配方烟丝，河南中烟工业有限责任公司提供;高浓混合浆，取自河南烟草工业薄片有限公司工艺生产线;果胶酶为由郑州轻工业大学食品科学与工程学院实验室筛选的微紫青霉sw09产出的粗果胶酶液，即发酵上清液.
　　试剂：3，5-二硝基水杨酸（DNS），天津市光复精细化工研究所产;果胶标准品（酯化度67%～70%），Sigma＼|Aldrich公司产;D-（+）-半乳糖醛酸一水化合物标准品（纯度97%）和0.15%的咔唑溶液，天津市光复精细化工研究所产.
　　仪器：ATY124型电子分析天平，日本岛津公司产;Ultra3400型紫外分光光度计，北京普源精电科技有限公司产;HH-2型电热恒温水浴锅，北京科伟永兴仪器有限公司产;Agilent6890/5973型气质联用仪，安捷伦科技有限公司产;CDSPYROPROBE2000裂解仪，上海光谱仪器有限公司产.
　　1.2 实验方法
　　1.2.1 微紫青霉产果胶酶粗酶液的获取
　　将活化后的微紫青霉sw09接种至发酵培养基（质量浓度分别为葡萄糖50 g/L，酵母浸粉3 g/L，KH2PO4 1 g/L，果胶2 g/L，pH=5）[15].发酵条件为：5 L发酵罐培养，搅拌速度150 r/min，通气量2 V/（V·min），发酵温度32 ℃，初始pH=5，发酵时间72 h.待发酵结束后，将发酵液离心取上清液，即为果胶酶粗酶液[16].
　　1.2.2 微紫青霉产果胶酶粗酶液降解混合浆中果胶单因素试验
　　酶活的定义为：在45 ℃，pH=5条件下，1.0 mL酶液每min分解果胶产生1.0 μg 的D-半乳糖醛酸，即为一个酶活单位（1 U/mL）.通过单因素试验研究不同酶活力、酶解时间和反应温度条件下，微紫青霉产果胶酶粗酶液对混合浆中果胶含量的降解情况.
　　1.2.2.1 不同酶活力的粗酶液降解果胶能力的试验[17]
　　将不同酶活力的粗酶液（14 000 U/mL，6000 U/mL，3000 U/mL，1000 U/mL，700 U/mL 和450 U/mL），以料液比（m（混合浆干重/g）GA6FAV（粗酶液体积/mL），下同）为1GA6FA3的比例均匀喷施于10 g混合浆上，在50 ℃下酶解2.0 h.待酶解结束后，置于70 ℃烘箱中使酶灭活，测定各处理组样品果胶含量，每组试验重复3次.
　　1.2.2.2 不同酶解时间下粗酶液降解果胶能力的试验
　　将酶活力为14 000 U/mL的粗酶液，以料液比1GA6FA3，均匀喷施于10 g混合浆上，在50 ℃下分别酶解0.5 h，1.0 h，1.5 h，2.0 h，2.5 h和3.0 h.待酶解结束后，置于70 ℃烘箱中使酶灭活，测定各处理组样品果胶含量，每组试验重复3次.

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