白芍药材薄层色谱鉴别和高效液相色谱特征图谱研究

　　摘要：目的 研究白芍的薄层色谱和高效液相色谱指纹图谱，为科学评价及有效控制其质量提供可靠方法。方法 采用薄层色谱法检测白芍样品中的芍药苷，展开剂为三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（40∶5∶10∶0.2）。采用高效液相色谱法，梯度洗脱，测定10批白芍样品。色谱条件为：Kromasil C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm， 12 nm），流速1.0 mL/min，柱温35 ℃，流动相A为乙腈，流动相B为0.05%磷酸水。结果 薄层色谱斑点清晰。10批白芍样品获得包括芍药苷（9号峰）在内的15个共有峰，其中安徽、浙江的白芍饮片指纹图谱相互之间差异较小。结论 白芍的指纹图谱特征性及专属性强，可用于白芍饮片的质量控制。
　　关键词：白芍；薄层色谱法；高效液相色谱法；指纹图谱
　　DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2014.11.029
　　中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2014）11-0095-03
　　白芍为毛茛科植物芍药Paeonia lactiflora Pall.的干燥根[1]，主要含有芍药苷、芍药内酯苷、羟基芍药苷、苯甲酰芍药苷和苯甲酰羟基、芍药苷等单萜类和苯甲酸、儿茶素、没食子酸等成分[2]，具有抗炎、抗氧化、免疫调节、抗肝损伤等作用[3]。本试验收集10批白芍样品，分别采用薄层色谱法（TLC）和高效液相色谱法（HPLC），对白芍的特征图谱进行系统研究，为科学评价和有效控制白芍药材的质量提供依据。
　　1 仪器与试药
　　日本岛津公司Shimadzu LC-20AB高液相色谱系统，包括在线脱气机、自动进样器Prominence SIL-20A、二极管阵列检测器SPD-M20A和柱温箱CTO-20A；KQ3200DB型数控超声仪，昆山市超声仪器有限公司；电子天平，BS2242S，北京赛多利斯仪器系统有限公司；RE-52旋转蒸发仪，瑞士步琪；硅胶预测薄层板，青岛海洋化工厂；色谱柱为YMC-Pack ODS-A （250 mm×4.6 mm，5 μm）。甲醇，分析纯，南京化学试剂有限公司；乙腈，色谱级，美国天地；自制去离子水。
　　10批白芍样品于夏、秋二季采挖，洗净，除去头尾和细根，置沸水中煮后除去外皮或去皮后再煮，晒干，经南京中医药大学陈建伟教授鉴定为毛茛科植物芍药Paeonia lactiflora Pall.的干燥根，产地见表1。
　　2 薄层色谱鉴别
　　取芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每 1 mL含1 mg的对照品溶液。取白芍样品，经60 ℃干燥，过夜，粉碎，过4号筛。取样品粉末0.5 g，置于锥形瓶中，加80%甲醇10 mL，超声处理30 min，过滤，滤液蒸干，残渣加乙醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。吸取上述2种溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（40∶5∶10∶0.2）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰。结果供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的蓝紫色斑点。斑点清晰，分离效果好，结果易于分辨。
　　3 高效液相色谱指纹图谱研究
　　3.1 色谱条件
　　色谱柱：Kromasil C18色谱柱（250 mm×4.6 mm， 5 ?m，12 nm）；流动相：乙腈（B）-0.1磷酸水溶液（A）；柱温：35 ℃；检测波长：254 nm；流速：1.0 mL/min；进样体积：10 ?L；梯度洗脱程序见表2。
　　3.2 供试品溶液的制备
　　称取上述10批白芍样品粉末各2 g，置于500 mL锥形瓶中，加80%甲醇20 mL，水浴回流提取1 h，过滤，残渣继续加20 mL甲醇，回流提取，合并滤液，回收溶剂。用80%甲醇溶解残留物，容量瓶定容至10 mL， 0.45 μm滤膜过滤，取续滤液，即得。
　　3.3 共有峰的标定
　　采用国家药典委员会颁布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版》软件自动匹配10批白芍药材的HPLC图色谱峰保留时间和峰面积等参数，以平均数法作为对照指纹图谱的生成方法，提取白芍药材的共有模式，建立对照指纹图谱。10批白芍药材的色谱叠加图见图1。经色谱分析，确立了15个共有峰，见图2。根据指纹图谱相似度评价结果得出各样品的相似度，10批样品来自安徽和浙江2个产地，因此存在一定的差异，但其相似度仍达到0.8以上，具有很好的相关性，相似度计算数据见表3。
　　3.4 精密度试验
　　取同一供试品溶液，按“3.1”项下色谱条件，于高效液相色谱仪上连续进样6次，记录色谱图及峰面积积分值，将图谱导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版》处理，得到各次进样的相似度，经分析，结果峰面积积分值RSD=0.25%，符合特征图谱的相关技术要求。以3号峰为参照，对各图谱共有模式中已标定的15个共有峰进行计算，各图谱共有峰相对保留时间及相对峰面积的RSD值分别在0.00%～0.27%和0.14%～3.58%之间，各主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积均无明显变化，表明仪器等整个系统的精密度良好。
　　3.5 重复性试验
　　取1号白芍样品共6份，按“3.2”项下方法制备供试品溶液，按“3.1”项下色谱条件，分别进样，记录色谱图及峰面积积分值，将图谱导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版》处理，得到各次进样的相似度，经分析，结果峰面积积分值RSD=0.28%，符合特征图谱的相关技术要求。以3号峰为参照，对各图谱共有模式中已标定的15个共有峰进行计算，各图谱共有峰相对保留时间及相对峰面积的RSD值分别在0.00%～1.06%和0.29%～3.52%之间，各主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积均无明显变化，表明该分析方法的重复性良好。

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