茶叶乙醇提取物清除自由基活性及相关性分析

　　摘要：以5种茶叶乙醇提取物为研究对象，测定其茶多酚、茶多糖、黄酮、茶红素、茶褐素、茶黄素以及茶色素的含量以及清除自由基能力，分析乙醇提取物中活性成分含量与清除自由基能力之间的关系，并建立回归模型。结果表明，不同品种茶叶提取物活性成分含量以及清除自由基能力均存在一定差异。相关性分析显示，茶叶提取物中茶黄素含量与羟基自由基清除能力呈显著负相关，茶褐素以及茶色素含量与DPPH·自由基清除能力呈显著负相关，茶多酚含量与超氧阴离子自由基清除能力呈显著正相关，相关系数分别为-0.883、-0.934、-0.887以及0.945。
　　关键词：茶叶；抗氧化；清除自由基；相关性分析
　　中图分类号：TQ91 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）13-3430-04
　　DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.13.040
　　作为人体外源性抗氧化物质的最重要来源，植物提取物的抗氧化研究开发日益受到重视[1]。自由基是指外层轨道含有未配对电子的原子、分子或基团，是需氧生物生命活动过程中许多生物化学反应的中间代谢产物。研究发现，自由基对机体的氧化损伤与有机体的多种疾病有关[2]。茶叶是天然抗氧化剂资源。近年来，研究者对不同品种茶叶中的黄酮、茶多酚、茶色素、茶多糖等活性成分的提取与抗氧化性能进行了分析，特别是在清除自由基方面进行了较多的研究[3-10]。本试验以5种茶叶为原料，比较5种茶叶乙醇提取物清除自由基的能力并探究其与茶黄酮、茶多酚、茶多糖等活性成分含量之间的相关性，以期为茶叶活性成分的提取提供参考。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料与仪器
　　1.1.1 材料与试剂 茶叶：高级绿茶，产地江苏无锡；明前毛尖，产地福建武夷山；名苑春芽，产地江苏句容；碧螺春，产地杭州钱塘；金寨翠绿，产地安徽金寨，5种茶叶均为一级。
　　标准品：芦丁标准品（色谱纯，南京泽郎医药科技有限公司）；没食子酸标准品（色谱纯，南京泽郎医药科技有限公司）；乙醇、乙酸乙酯、碳酸氢钠、苯酚、硫酸、邻苯三酚、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、草酸、葡萄糖、水杨酸、过氧化氢（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；10%福林酚试剂（分析纯，上海荔达生物科技有限公司）；DPPH·自由基（分析纯，北京中生瑞泰科技有限公司）。
　　1.1.2 主要仪器设备 电子天平：JA5003N型，上海精密科学仪器有限公司；分光光度计：WFJ7200型，尤尼柯（上海）仪器有限公司；微波萃取仪：MAS-2型，上海新仪微波化学科技有限公司。
　　1.2 方法
　　1.2.1 样品的制备 采用微波辅助法提取茶多酚，称取经粉碎的茶叶约1 g，按料液比1∶35加入80%的乙醇溶液于微波专用的三颈烧瓶中，置于微波反应器内，调节微波时间3 min、微波温度65 ℃、微波功率400 W进行萃取。将萃取液趁热过滤，3 000 r/min离心10 min，取上清液经旋转蒸发仪浓缩、真空干燥后得到乙醇提取物。
　　1.2.2 活性物质测定
　　1）茶多酚含量的测定。提取物中茶多酚含量的测定参照Folin-Ciocalteu比色法[11]。765 nm处测定其吸光度，根据没食子酸标准品的吸光度所得标准曲线计算样品中茶多酚的含量。没食子酸标准曲线为y=0.016 5x+0.012，R2=0.998 0。
　　2）茶黄酮含量的测定。参照文献[12]采用硝酸铝络合分光光度法测定总黄酮。420 nm波长处测定其吸光度，根据芦丁标准品的吸光度绘制标准曲线，计算样品中茶黄酮含量。芦丁标准曲线为y=9.07x-0.004，R2=0.998 7。
　　3）茶红素、茶黄素、茶褐素以及茶色素含量测定。茶色素测定按Roberts等[13]的方法略有修改。准确称取茶叶提取物0.2 g，用水溶解稀释到100 mL。吸取稀释液25 mL，加乙酸乙酯25 mL，振荡后取乙酸乙酯萃取液2 mL，加入95%乙醇定容至25 mL得到a液。吸取乙酸乙酯萃取液15 mL，加入2.5% NaHCO3溶液15 mL，剧烈振荡30 s后，吸取乙酸乙酯上层液4 mL，用95%乙醇定容至25 mL得到c液。吸取第一次水层待用液2 mL，加入2 mL饱和草酸溶液和6 mL水，用95%乙醇定容至25 mL得到d液。再分别吸取25 mL稀释液和25 mL正丁醇，振荡后取水层2 mL，加入2 mL饱和草酸溶液和6 mL水，用95%乙醇定容至25 mL得到b液。以95%乙醇做空白，在380 nm波长处分别测定各溶液的吸光度。
　　茶黄素含量=A×2.25/m×100%；茶红素含量=（2Aa+2Ad-Ac-2Ab）×7.06/m×100%；茶褐素含量=7.06×2Ab/m×100%；茶色素含量=茶红素+茶褐素+茶黄素。以上公式中，m为试样质量；Aa、Ab、Ac、Ad分别为溶液a、b、c、d的吸光度。
　　4）茶多糖含量的测定。采取苯酚硫酸法[14]测定。在490 nm处测定吸光度，并根据葡萄糖标准品吸光度所得标准曲线计算样品中的茶多糖含量。葡萄糖标准曲线为y=1.361 8x-0.019 7，R2=0.996 6。
　　1.2.3 茶叶提取物自由基清除能力测定
　　1）DPPH·自由基清除率的测定：根据文献[15]测定，结果以维生素C作阳性对照。
　　2）羟自由基清除率：参照文献[14]测定，以维生素C作阳性对照，进行对照试验[14]。计算清除率。
　　清除率=（[Ao-Ax-Axo）/Ao]×100%。
　　式中，Ao为对照组吸光度，Ax为多糖样品吸光度，Axo为本底管吸光度。
　　3）超氧阴离子自由基清除率：超氧阴离子自由基清除率的测定采用邻苯三酚法[16]。320 nm下测定相应吸光度，结果以维生素C作阳性对照。

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