以核基因ITS2片段为DNA条形码鉴定中药材威灵仙的研究分析

　　【摘要】 目的：探讨以核基因ITS2片段为DNA条形码鉴定中药材威灵仙的效果，从而为临床用药提供依据。方法：选取18份威灵仙药材样品以及混伪品作为研究对象，提取威灵仙的DNA，利用PCR技术扩增其ITS2序列，双向测序，所得的序列经过CodonCode Aligner进行拼接，采用HMMer注释法对网上数据进行分析，并构建NJ（邻接）树。结果：威灵仙药材的三个基源植物为毛茛科威灵仙、东北铁线莲、棉团铁线莲，其序列长度分别为230 bp、230 bp、220 bp；威灵仙药材正品来源的三种植物聚集为一枝，其支持率为83%；威灵仙与混伪品在二级结构上具有明显的差异。结论：核基因ITS2片段作为DNA条形码能够稳定以及准确的鉴别中药材威灵仙以及混伪药品，从而为保障临床安全用药提供一种新的技术手段，具有广阔的应用前景。
　　【关键词】 ITS2片段； DNA条形码； 中药材； 威灵仙
　　中图分类号 R28 文献标识码 B 文章编号 1674-6805（2014）8-0155-02
　　威灵仙属于药用植物，药材基源以及来源比较多，在我国内分布较广泛，其根茎入药具有通经络、风湿以及消骨哽的功效，在胆结石、足跟痛以及食管癌等治疗上起着重要作用[1]。作为常用中药，地区用药习惯的差异性较大，导致威灵仙使用混乱现象比较严重，因此有必要对威灵仙以及混伪品进行鉴别研究。近年来，DNA条形码技术因其具有较强的通用性以及鉴定结果可重复性的优点，因而被广泛应用于中药材的鉴定中。本文就运用核基因ITS2片段来鉴定中药材威灵仙以及混伪品，从而为临床用药提供科学依据，现报告如下。
　　1 资料与方法
　　1.1 一般资料
　　本文选取的18份威灵仙样品均来自Genbank下载序列，主要有棉团铁线莲、东北铁线莲、毛蕊铁线莲、须蕊铁线莲、柱果铁线莲、草珊瑚、桃儿七、芍药以及土茯苓。此样品均经过余霖副研究员鉴定，同时此标本均在中国医学科学院药用植物研究所标本馆得以保存。
　　1.2 鉴定方法
　　1.2.1 DNA提取 植物DNA提取试剂盒则来自北京天根生物技术有限公司；2×Tag PCR Master Mix采用北京艾德生物科技公司。采用70%的乙醇擦洗药材样品表面，擦洗完成之后进行研磨；进而取出16 mg的样品；采用硅胶对植物叶进行干燥，取30 mg样品；最后采用提取试剂盒进行DNA的提取。
　　1.2.2 PCR扩增以及侧序 引物均由北京赛百盛基因技术有限公司合成。扩增引物正向为5’-GCGATACTTGGTGTGAAT-3’，反向为5’-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3’。扩增程序为：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，40转；72 ℃10 min。PCR体系含有25 mm的MgCl2 2 μl，2.5 mm的dNTP 2 μl，PCR bufer 2.5 μl（10×）。引物为1.0 μl（2.5 μm），聚合酶为1.0 U，DNA总共为1 μl，反应体积为25 μl。PCR扩增产物纯化之后，采用ABI3730XL测序仪进行双向测序[2-3]。
　　1.3 数据处理分析
　　所有序列采用CodonCode Aligner V2.06校对拼接，去除引物区。对于网上所获取的ITS序列，均采用HMMer注释法进行分析进而获得ITS2间隔序列。然后，将所有序列采用软件MEGA5.0进行分析对比。采用NJ邻接法对利用对比过的序列构建系统聚类树，对各种物种进行鉴定。最后，根据ITS2数据库以及网站对ITS2的二级结构进行预测。
　　2 结果
　　2.1 序列比较
　　威灵仙药材的三个基源植物分别为毛茛科威灵仙（clematis chinensis osbeck）、东北铁线莲（clematis manshurica rup）、棉团铁线莲（clematis hexapetala pall）。其序列长度分别为230 、230、220 bp。威灵仙与东北线铁链、棉团铁线莲之间的距离分别为0.017、0.006。由此看出，威灵仙与三个药品源的遗传距离最小，并且差异最小。草珊瑚与棉团铁链、东北线铁线莲之间的遗传距离分别为1.077、1.146，得出其他药品之间的遗传距离相对较大。
　　2.2 聚类分析
　　通过邻接法构建系统聚类树，看出威灵仙不同来源样品为一枝，呈现明显的单系性，其支持率为83%。
　　2.3 威灵仙以及混伪品ITS2的序列二级结构
　　威灵仙与三个混伪品在二级结构上具有明显的差异，主要表现在茎环（loop）的大小、树木以及位置上，不同物种之间或多或少都存在一定的区别。
　　3 讨论
　　威灵仙（radix clematidis）为双叶子植物毛茛科植物威灵仙、棉团铁线莲（山蓼）或者东北铁线莲（黑薇）的干燥根以及根茎[4]。具有通经止痛的效果，在临床用药中得到广泛应用。然而，由于地方用药之间存在一定的差异，使得威灵仙用药混乱现象较为严重。如南方则以毛茛科铁线莲属Clematis植物作为威灵仙的入药，北方则以百合科菝葜属Smildx植物作为威灵仙入药。同时由于没有专业以及统一的鉴定人员对威灵仙药材进行鉴定，使得使用者使用该药物之后，中毒现象时常发生，对人体身体健康带来严重影响[5]。鉴于此种情况，需要一种简单并且迅速的方法来对威灵仙药材以及伪劣品进行鉴别。
　　传统的中药材鉴定方法如化学指纹图谱等鉴定方法、显微结构形态、以及超微结构方法等，在中药材鉴定以及评价质量上起着重要作用[6]。然而，由于中药饮片、中药粉末以及含有生药原型的传统中成药的鉴定较为困难，这些方法已经不能精确对其地进行鉴定。准确的物种鉴定是人类认知生物多样性的前提条件，在此种环境下，DNA条形码应运而生。DNA条形码主要是利用基因组中相对较短的DNA片段进行药材物种进行鉴别的手段。通过此种方法能建立DNA条形码数据库以及鉴定平台，实现药材正品与伪劣品的鉴别。另一方面，ITS2序列的长度较短，容易扩增，同时作为ITS的一部分，在系统化研究中得到广泛应用，同时也是药用植物DNA条形码鉴定中最优的序列。国内外已经有学者对其序列组合进行研究[7-9]，同时提出了不同的序列组合来作为植物鉴定的条形码。据文献[10-11]报道，其鉴定物种水平的能力达到93.1%，优于国际条形码协会提出的组合标准。在本次研究中，通过ITS2片段能够鉴定出威灵仙与混劣品之间的差异。

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