不同栽培品种毛橘红药材HPLC指纹图谱

　　[摘要]目的：探讨化州柚栽培品种间的质量差异，为寻找良种提供科学依据。 方法：采用HPLC建立化州市绿色生命有限公司GAP基地不同栽培品种毛橘红药材指纹图谱，采用国家药典委员会 “中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004 A版”软件进行相似度分析及品种判定。结果：不同栽培品种样品指纹图谱整体特征相似，18个共有峰峰面积相似度在0.938～0.998，利用相似度软件判定栽培品种成功率为92%。结论：应用该法可较好地判别毛橘红药材质量优劣及品种来源，并可为化州柚良种寻找提供技术手段和科学依据。
　　[关键词]毛橘红；指纹图谱；不同栽培品种；质量控制；种质资源
　　祛痰镇咳常用中药化橘红基源为化州柚Citrus grandis ‘Tomentosa’和柚C. grandis。《本草原始》云：橘红，广东化州者胜。自古以来，化橘红均以化州市特有树种——化州柚未成熟外层果皮入药，其外果皮密被绒毛，习称毛橘红[1]。化州柚是柚的栽培变种，经于化州市特定环境的长期生长繁衍，其树形、树叶、果实等原植物外形发生了一定程度的分化，当地药农根据其原植物外形分化，提出黄绒果、假西洋、金钱肚、凤尾、陆福等化州柚药材品种[2]。
　　课题组研究发现，毛橘红与光橘红在黄酮类成分、挥发油成分等均有明显的差异[3]，利用信息熵的方法可快速识别毛橘红与光橘红[4]；不同栽培品种的化州柚药材总黄酮和柚皮苷的含量均不相同，大茶岭和凤尾2品种药材含量均明显高于其他栽培品种[2]。为了进一步探讨化州柚栽培品种间的质量差异，为寻找良种提供科学依据，作者进行本项研究。
　　1材料
　　试验所用毛橘红药材样品均采自化州市绿色生命有限公司化橘红GAP基地，经由广州中医药大学林励研究员鉴定，其基源为化州柚C. grandis ‘Tomentosa’。柚皮苷、野漆树苷、柚皮素（均为自制，采用峰面积归一化法计算，纯度分别为98.21%，99.32%，98.68%），芹菜素（北京恒元启天化工技术研究院，批号520-36-5）；甲醇（色谱纯，德国默克公司，批号603-001-00-X），冰乙酸（优级纯，天津市科密欧，批号20090919）；其余所用试剂均为分析纯。
　　Waters 2965 HPLC系统 （Waters Corporation， Milford， MA， USA）：四元泵，在线真空脱气系统，自动进样器，柱温箱，DAD检测器，Empower3工作站。
　　2方法
　　2.1色谱条件Waters Symmetry C18色谱柱 （4.6 mm×250 mm， 5 μm）。流动相为A（甲醇）-B（2%醋酸溶液），采用梯度洗脱：0～8 min，0～10%A；8～12 min，10%～12% A；12～15 min， 12%～13% A；15～25 min， 13%～25% A；25～60 min， 25%～55% A；60～65 min，55%～62% A；65～68 min，62%～70% A。流速1.0 mL·min^-1 ，检测波长330 nm；柱温箱（35±5） ℃；进样量10 μL。
　　2.2对照品溶液的制备取柚皮苷、野漆树苷、柚皮素、芹菜素对照品适量，精密称定，加甲醇制成质量浓度分别为20，0.3，1.5，0.04 g·L^-1的混合对照品储备液。
　　2.3检测波长考察采用二极管阵列检测器对检测波长进行考察，分别提取在283，310，330，345 nm波长处的色谱图，以柚皮苷、野漆树苷、柚皮素、芹菜素为对照品，结果在330 nm下色谱峰峰数多，基线比较平稳，色谱信息最为丰富，因此选择该波长作为检测波长。
　　2.4供试品提取按照文献[5]方法，精密称定干燥至恒重的样品粉末（过4号筛）0.2 g，每个样品平行做3份，置具塞锥形瓶中，加石油醚20 mL，超声提取（500 W，40 kHz）30 min，弃去石油醚液，待样品中残存的石油醚全部挥去后，加甲醇20 mL，密塞，精密称定，超声提取30 min，取出，放凉，甲醇补足失重，摇匀，滤过，并用甲醇洗涤滤器和滤渣数次，滤液全部转移到100 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，取适量用0.45 μm滤膜过滤，即得。
　　2.5测定方法分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，见图1。
　　3结果
　　3.1精密度考察精密吸取毛橘红样品（37号）溶液10 μL，连续进样5次，考察色谱峰保留时间的一致性，各主要色谱峰保留时间和峰面积基本一致，在同一仪器测得的色谱指纹图谱与其共有模式图谱的相似度大于0.99（中位数），符合指纹图谱的要求。
　　3.2重复性考察取同样批号的样品5份，同上操作，考察色谱峰保留时间的一致性，各主要色谱峰保留时间和峰面积基本一致，在同一仪器测得的色谱指纹图谱与其共有模式图谱的相似度大于0.99（中位数），符合指纹图谱的要求。
　　3.3稳定性考察精密吸取毛橘红样品（37号）溶液10 μL，分别在1，8，16，24，48 h连续测定5次，以选定的柚皮苷色谱峰为观测指标，考察色谱峰保留时间的一致性，各主要色谱峰保留时间和峰面积基本一致，在同一仪器测得的色谱指纹图谱与其共有模式图谱的相似度大于0.99（中位数），表明在48 h内供试品溶液稳定性良好。
　　3.4毛橘红药材HPLC指纹图谱中的特征峰采集50批毛橘红药材的HPLC指纹图谱，采用国家药典委员会编写的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版”软件（以下简称相似度评价系统A版），生成毛橘红药材共有模式的对照指纹图谱，见图2，其中共有色谱峰18个，9～11，14号峰分别为柚皮苷、野漆树苷、柚皮素、芹菜素的色谱峰。为便于辨认和分析，将共有色谱图分成3个区，Ⅰ区包括1～8号峰（tR 9.7～30.8 min），Ⅱ区包括9～11号峰（包括柚皮苷、野漆树苷、柚皮素峰，tR 30.8～40.8 min），Ⅲ区包括12～18号峰（包括芹菜素峰，tR 40.8～62.6 min）。

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