基于形态特征和DNA条形码技术的维吾尔药材沙枣基原鉴定

　　[摘要]该研究从形态学及分子生物学角度研究新疆维吾尔医常用药材沙枣的基原是否为胡颓子属3种沙枣。随机选择不同产地3种沙枣的叶片、花、果实，通过形态学比较外观差异；使用DNA条形码ITS2序列对新疆3种17份沙枣ITS2序列进行PCR扩增和测序，比较17份样品ITS2序列种内和种间变异、采用NJ树法及ML法对其亲缘关系进行分析，结果表明新疆胡颓子属3种沙枣叶片、花、果实均无明显区别特征，肉眼不易区分；沙枣、尖果沙枣、东方沙枣ITS2序列长度变化范围为220～223 bp，平均GC质量分数为61.9%，单倍型数分别为4，3，3，NJ树及ML树均不能将三者区分。因此，从分子生物学角度看，新疆胡颓子属3种沙枣可能为同一起源，均可作为维吾尔药材沙枣的基原植物，但需进一步结合其分布、化学成分和药理药效等因素进行综合深入的研究。
　　[关键词]DNA条形码；ITS2；沙枣；鉴定；基原植物
　　沙枣是胡颓子科Elaeagnaceae胡颓子属Elaeagnus植物，主要分布在我国新疆和内蒙古西部，其树皮、枝叶、花、果等皆为维吾尔医常用药材，果实可治疗头痛、热性咳嗽、腹泻等^[1]；树皮具有清热凉血、收敛止痛的功效^[2]；花可治疗慢性支气管炎^[3]。现代药理学研究证明，药材沙枣具有促进伤口愈合^[4]、抗菌杀虫^[5]、镇痛^[6-7]和松弛肌肉^[8]等功效。除此之外，沙枣树还具有抗风沙、耐盐渍、耐干旱的特质，是防风固沙、开荒造田的首选林木，是集多种功能为一体的经济型树种。我国分布的胡颓子属沙枣的种类不多，但存在争议，《中国植物志》和《新疆植物志》中收载了沙枣E. angustifolia、尖果沙枣E. oxycarpa及东方沙枣E. angustifolia var. orientalis（变种）^[9-10]，《中国沙漠植物志》还收录了大果沙枣E. moorcroftii^[11]。沙枣采用经典植物分类鉴定方法定种困难，需要同时依据花期及果期特征，常常同份标本鉴定出不同结果。黄俊华等^[12]采用定株标记采集、花果同时比较的方法，结合多份标本，根据叶、花和果实特征，将新疆沙枣分为3种1变种；于玮玮等^[13]对大果沙枣和尖果沙枣的染色体核型进行分析，结果显示，虽然两者染色体结构存在细微差别，但起源和演化中存在一定的亲缘关系。《中华人民共和国药品标准（维药分册）》药材“沙枣”仅收载了沙枣E. angustifolia^[14]，而新疆传统习惯以沙枣、尖果沙枣及东方沙枣药用为主，大果沙枣食用为主[1，15]。因此，研究和明确维吾尔药材沙枣的基原植物，对实现其标准化、现代化具有重要的意义。
　　目前维吾尔药材沙枣的相关研究多集中在形态和化学成分比较等方面，相关种源鉴定鲜见报道。DNA条形码研究已成为近年来生物分类学研究的热点和前沿，它是一种利用基因组中一段通用的标准短序列来进行物种鉴定的分子诊断新技术^[16]，通过建立生物DNA条形码系统能够实现快速、准确和自动化的物种鉴定。陈士林研究团队证明：ITS2序列可以作为标准DNA条形码鉴别药用植物及其近缘物种^[17-20]，并以ITS2序列为基础初步建立了药用植物DNA条形码数据库网络查询系统。2011年，中国植物条形码工作组（Chinese Plant BOL Group）建议将ITS/ITS2序列作为种子植物的核心DNA条形码^[21]。本研究采用此方法研究新疆胡颓子属植物，旨在明确维吾尔药材沙枣的植物基原，为维吾尔药材的标准化提供科学的依据与方法。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料
　　3种沙枣样品包括叶片、花、果实采自新疆各地，DNA条形码实验材料按照标准规则采集，由中国医学科学院药用植物研究所林余霖研究员鉴定，同时以胡颓子科植物沙棘作为外类群进行研究。凭证标本保存于新疆中药民族药研究所标本馆（新疆XTNM），实验所获得的序列已提交至GenBank，详见表1。
　　PCR扩增所用引物ITS2序列由生工生物工程合成，其正向序列为5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′，反向序列为5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′；DNA提取试剂盒、DNA聚合酶及dNTP等均购自天根生物。
　　实验所使用的DNA提取研磨仪为GRINDER，型号GT-100；离心机为上海安亭科学仪器，型号Anker TGL-16C；PCR扩增仪为An Analytik Jena company，型号070-851。
　　1.2 方法
　　1.2.1 3种沙枣外观形态比较 随机选择不同产地3种沙枣的叶片、花、果实，测定叶片长宽、果实大小及形状等进行形态学比较。
　　1.2.2 DNA的提取及检测 称取干燥叶片30 mg、果实25 mg，使用DNA提取研磨仪1 000 r·min-1研磨2 min，植物DNA提取试剂盒提取总DNA，1%琼脂糖凝胶电泳检测条带大小及质量。
　　1.2.3 PCR扩增及测序^[22] 反应体积25 μL，包括dNTP 0.4 μL（10 mmol·L-1），PCR缓冲液2.5 μL（10×），引物各1.0 μL（2.5 μmol·L-1），聚合酶1.0 U，总DNA 1 μL（约30 ng）；扩增程序：94 ℃，变性5 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s（40个循环）；72 ℃延伸10 min；扩增结果由美吉生物测序公司双向测序。
　　1.2.4 数据处理 测序峰图用CodonCode Aligner V 4.0.4（CodonCode Co.，USA）校对拼接，去除引物区。将所有序列由软件MEGA5.0（molecular evolutionary genetics analysis）分析比对^[23]，ITS2序列基于隐马尔可夫模型的HMMer注释方法，去除两端5.8S和28S区段获得ITS2间隔区序列^[24]，基于K2P模型分析种内变异和种间变异[16，25]。用邻接（NJ）法及最大似然法（ML）构建系统聚类树，使用bootstrap（1 000次重复）检验各分支的支持率^[26]。

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