HPLC测定马甲子药材中马甲子1#的含量

　　摘要：建立HPLC测定马甲子1#含量的方法，采用BDS HYPERSIL C18色谱柱（4.6mmxlOOmmx2.4μm），以乙腈-O.1%甲酸溶液为流动相，梯度洗脱，流速为1.OmL/min，检测波长为320nm。结果表明马甲子1#在0.0214-0.8544μg（r=0.9999）范围进样量与峰面积线性关系良好，平均加样回收率为99.4%（RSD=1.18%）。该方法快速，准确，重现性好，可用于测定马甲子中马甲子1#的含量。
　　关键词：马甲子；马甲子l#；高效液相色谱法（HPLC）；含量测定
　　文献标志码：A
　　文章编号：1674-5124（2015）04-0043-03
　　0 引言
　　马甲子Paliurus ramosissimus（Lour.）Poir系鼠李科铜钱属植物，又名铁篱笆、铜钱树。其根部具有发表解热，祛风利湿，治跌打损伤及心腹疼痛的功能，其叶具有治痈疮溃疡作用。经本课题组的前期研究证实其叶也具有抗肿瘤作用且疗效较好。为了探索马甲子叶中的相关活性成分，本文对马甲子叶中的某些戍分进行了提取分离、结构鉴定和抗肿瘤等方面的研究，得到了新的活性单体马甲子l#，为了进一步研究该成分，制定了本文的含量测定方法。
　　1 实验部分
　　1.1 仪器与试药
　　1200高效液相色谱仪（美国安捷伦）；SartoriusBS2IOS电子天平（北京赛多利斯天平有限公司）。
　　乙腈（色谱纯，美国Sigma公司）；水（乐百氏纯净水）；甲酸、甲醇（分析纯，成都市科龙化工试剂厂）。
　　药材：于2013年6月采自四川省牧马山的鲜叶，经鉴定为鼠李科铜钱属植物马甲子Paliurus ramo-sissimus（Lour.）Poir.，冷冻干燥备用；马甲子l#对照品（成都普瑞法科技开发有限公司，批号：14070109），纯度经归一化法测定为97.4%。马甲子1#经结构鉴定，未见相关文献报道，属于新化合物，结构式见图l。
　　1.2 方法与结果
　　1.2.1 色谱条件及系统适用性试验
　　色谱柱为BDS HYPERSIL C18色谱柱（4.6mmX100 mmx2.4μm，Thermo Fisher Scientific）；以乙腈为流动相A，0.1%甲酸溶液为流动相B，按表l进行梯度洗脱；检测波长为320nm；柱温为30℃；流速为1.0 mL/min；进样量为10μL。理论塔板数按马甲子1#计算应不低于3000。分别选择乙腈-水，乙腈-0.1%冰醋酸溶液，乙腈-0.1%甲酸溶液为流动相，考察不同流动相系统对样品的分离效果。结果表明，采用乙腈-0.1%甲酸溶液系统时主峰与杂质峰分离较好，且分离度>1.5，故选择乙腈-0.1%甲酸溶液系统。在小范围内改变进样体积、柱温及流速，色谱图无明显变化。对照品和供试品溶液的色谱图分别见图2（a）和图2（b）。
　　1.2.2 样品的制备
　　精密称取马甲子1#对照品适量，用甲醇制成含马甲子1#0.1068mg/mL的对照品贮备液。分析测试中所用对照品溶液由对照品贮备液稀释得到。
　　取马甲子药材粉末（过4号筛）约2.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入95%乙醇50mL，称定质量，回流提取2h后，取出，冷却，再称定质量，用95%乙醇补足损失的质量，摇匀，滤过，即得供试品溶液。
　　1.2.3 线性范围考察
　　分别精密移取马甲子l#对照品贮备液0.2，0.5，1.0，2.0，5.0，8.0mL置于lOmL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀。按“1.2.1”项下的色谱条件测定马甲子1#的峰面积，并以进样量对其峰面积进行线性回归，得到回归方程为：Y_马甲子1#=2.396x10³X-4.758（r=0.9999）。结果表明马甲子1#在0.0214-0.8544μg范围进样量与峰面积线性关系良好。结果见图3。
　　1.2.4 精密度试验
　　取含马甲子1#0.02136mg/mL的对照品溶液，重复进样5次，计算马甲子1#峰面积的RSD为0.73%，结果表明进样精密度良好。
　　1.2.5 重复性试验
　　取同一批号的马甲子药材粉末（过4号筛）6份，按“1.2.2”项方法制备供试品溶液，测定，计算马甲子1#含量的RSD为0.70%，结果表明方法重复性良好。
　　1.2.6 稳定性试验
　　取同一对照品溶液，于室温下0，2，4，6，8，12，24h分别进行测定，以峰面积为指标计算马甲子1#的RSD为1.05%，结果表明供试品溶液在24h内稳定。
　　1.2.7 加样回收率试验
　　称取已测定含量的马甲子药材粉末（过4号筛）约2.5 9，精密称定，置具塞锥形瓶中，共6份，分别精密加入对照品贮备液SmL，精密加入95%乙醇50mL，按“1.2.2”项下方法制备供试品溶液，测定，结果表明回收率较好（见表2）。
　　1.2.8 样品测定
　　在本文色谱条件下，被测成分与其他化合物色谱峰分离度均良好。对10批马甲子药材进行测定，结果见表3。
　　2 讨论
　　马甲子药材中马甲子l#含量的测定试验，通过前期单因素试验考察了马甲子1#的提取工艺，并从操作便捷性和节约资源等方面综合考虑最终确定了供试品溶液的制备方法。用本文色谱条件测定10批马甲子药材中马甲子1#的含量，其中批号140523的药材中马甲子1#含量最高，同时该批次马甲子药材抗肿瘤活性最强，由此进一步确定其为马甲子药材抗肿瘤活性成分之一。马甲子l#含量的测定能够初步评价不同产地、不同采收期马甲子药材的质量，为民间癌症患者用药提供了一定的参考。
　　3 结束语
　　目前对马甲子的研究主要集中在其根、茎、果实中化学成分的分离鉴定，而马甲子叶中化学成分的研究未见报道。马甲子l#属于从马甲子叶中分离得到具有门桦酸母核的新的五环三萜类化合物，具有一定的抗肿瘤活性，有较好的研究前景。本文所建立的HPLC法能有效地将马甲子药材中马甲子l#与其他成分分开，分离度>1.5，且峰形较好，分析时间短，为马甲子1#定量分析提供了参考，为后期的深入研究奠定了一定的基础。

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