HPLC测定通关藤药材及消癌平片中通关藤苷A含量

　　摘要：目的 建立通关藤药材及消癌平片中通关藤苷A的高效液相色谱含量测定方法。方法 色谱柱：Sinochrom ODS-BP分析柱（250 mm×4.6 mm，5 ?m）；流动相：乙腈-0.1%磷酸（41∶59）；检测波长：230 nm。结果 通关藤苷A在0.996～19.92 ?g范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系，r=0.999 95，平均加样回收率为96.6%，RSD=2.19%（n=6）。结论 本方法操作简单，结果准确，稳定性和重复性好，可用于通关藤药材及消癌平片的含量测定及质量控制。
　　关键词：通关藤；消癌平片；通关藤苷A；高效液相色谱法
　　DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2013.03.021
　　中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2013）03-0055-03
　　通关藤，又名乌骨藤、通光散、通光藤等，是萝藦科牛奶菜属植物通关藤Marsdenia tenacissima（Roxb）.Wight et Arn的干燥茎、藤[1]，主要分布于贵州、云南、广西等地。通关藤含有多种化学成分，包括C21甾体苷类、三萜皂苷类、多糖类、醇类、挥发油、生物碱、有机酸类等化学成分。消癌平片是由通关藤制成的单方制剂，具有清热解毒、止咳平喘、散结止痛、抗癌之功效[1]。通关藤提取物在体外对胃癌、肝癌、食管癌等癌细胞具有抑制作用[2-4]。已有研究表明，C21甾体皂苷类为通关藤中主要抗肿瘤成分[5]。然而，目前文献报道的消癌平制剂多以绿原酸的含量为评价指标。本研究拟建立通关藤苷A的高效液相色谱（HPLC）含量测定方法，为规范通关藤药材及其制剂的质量提供依据。
　　1 仪器与试药
　　Agilent1100高效液相色谱仪，包括Agilent G1321A四元泵、G1322A真空在线脱气机、G1313A自动进样器、G1315 DAD二极管阵列检测器、Agilent安捷伦化学工作站；KQ3200DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；BP211D电子天平（德国赛多利斯公司）。
　　通关藤苷A对照品（纯度≥98.3%），山西省中医药研究院方剂研究所自制。5批消癌平片（批号091220、091221、091222、091224、091227），江苏天禾制药有限公司生产。乙腈为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。
　　通关藤药材经山西省中医药研究院李先荣主任药师鉴定。采收时间及产地见表1。
　　2 方法与结果
　　2.1 供试品溶液的制备
　　取通关藤药材过60目筛粉末1 g，精密称定，置于锥形瓶中，加入40 mL甲醇，超声30 min（功率150 W，频率40 kHz），滤过，滤液浓缩，定容于10 mL量瓶中，即得通关藤药材供试品溶液。
　　称取消癌平片20片，去包衣，精密称定，碾细，取2.4 g粉末，加120 mL蒸馏水于烧杯中溶解。滤过，滤液用氯仿萃取3次，每次30 mL，收集氯仿层，合并萃取液，水浴蒸干，甲醇定容至5 mL，即得消癌平片供试品溶液。
　　2.2 对照品溶液的制备
　　称取通关藤苷A 10 mg，精密称定，置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解，定容，即得0.996 mg/mL对照品溶液。
　　2.3 色谱条件
　　色谱柱：Sinochrom ODS-BP分析柱（250 mm×4.6 mm，5 ?m）；流动相：乙腈-0.1%磷酸（41∶59）；检测波长：230 nm；进样量：10 ?L；柱温：室温。理论塔板数按通关藤苷A峰计算应不低于1 500。通关藤苷A峰型良好，色谱图见图1。
　　2.4 标准曲线的绘制
　　分别精密吸取通关藤苷A对照品溶液1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0 ?L，注入高效液相色谱仪，依法测定，以通关藤苷A进样量（?g）为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，进行线性回归，得回归方程Y=441 389X-62.216，r=0.999 95。结果表明，通关藤苷A进样量在0.996～19.92 ?g范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系。
　　2.5 精密度试验
　　精密吸取上述对照品溶液10 ?L，注入高效液相色谱仪，重复进样6次，测定峰面积。结果RSD=0.13%（n=6），表明仪器精密度良好。
　　2.6 稳定性试验
　　精密吸取同一供试品溶液10 ?L，注入高效液相色谱仪，分别于0、2、4、8、16、24 h测定峰面积。结果RSD=1.16% （n=6），表明供试品溶液在室温下24 h内稳定。
　　2.7 重复性试验
　　取同一产地通关藤药材1 g，6份，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，分别精密吸取各供试品溶液10 ?L，注入液相色谱仪，测定峰面积。结果通关藤苷A平均含量为0.142 55 mg/g， RSD=2.34%（n=6），表明方法重复性良好。
　　2.8 加样回收率试验
　　取0.5 g通关藤药材（SS8）3份，分别加入5 mL通关藤苷A和甲醇35 mL，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，分别精密吸取各供试品溶液10 ?L，注入液相色谱仪，测定峰面积积分值，计算回收率分别为98.2%、97.4%、94.2%，平均回收率为96.6%，RSD=2.19%（n=6）。
　　2.9 样品含量测定
　　取“2.1”项下配制的不同产地通关藤供试品溶液及消癌平片供试品溶液分别注入液相色谱仪，测定峰面积积分值，由标准曲线计算质量，从而算出药材及消癌平片中所含对照品通关藤苷A的含量，结果见表2、表3。
　　3 讨论
　　通过对通关藤苷A对照品和不同产地通关藤药材扫描，最大吸收波长均在223 nm处，所以检测波长采用223 nm。本试验所采用的含量测定方法操作简单，重复性良好，可用于通关藤苷A的含量测定。
　　不同产地通关藤药材中通关藤苷A含量差异大。明显可分为3个范围：药材SS1、SS8、SS9接近，在0.9%左右；药材SS3、SS5、SS7、SS6相差不大，在0.5%～0.6%之间；药材SS2、SS4中含量相对较低。
　　消癌平片为通关藤药材的水提物制剂，前期用D101及ZTC树脂处理过该片剂，但杂质峰明显，且操作复杂、费时，后改用液-液萃取法，得到的溶液中杂质含量低，操作简便省时，不影响通关藤苷A的含量测定，可用于消癌平片中通关藤苷A的含量测定。
　　参考文献：
　　[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：278.
　　[2] 赵陆华，朱萱萱，张忠华，等.乌骨藤提取物对人肝癌细胞（HepG2）增殖的实验研究[J].中华中医药学刊，2008，26（12）：2633-2635.
　　[3] 张明智，何振，吴广银，等.消癌平对Ec-9706食管癌细胞的作用及机制实验[J].时珍国医国药，2008，19（5）：1182-1184.
　　[4] 李茂全，沈建华，胥彬，等.消癌平对SGC-7901胃癌细胞的作用及机制的实验研究[J].介入放射学杂志，2001，10（4）：228-230.
　　[5] 于少帅，陈明苍，李志雄，等.通关藤的化学成分与药理活性研究进展[J].
　　中国实验方剂学杂志，2011，17（21）：279-283.
　　（收稿日期：2012-07-08，编辑：陈静）

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