干蟾皮药材中华蟾酥毒基的含量测定

　　[摘要] 目的 建立了干蟾皮中华蟾酥毒基的含量测定方法。 方法 色谱法：采用Waters Xbridge C18反相色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：0.5%磷酸二氢钠溶液∶乙腈（52∶48）加磷酸调pH 3.2；检测波长为294 nm；流速：1 mL/min；柱温为室温。 结果 华蟾酥毒基在进样量2.5～15.0 μg（r = 0.9999）范围内呈良好的线性关系，线性回归方程y = -4×107x-10 196（r = 0.9999）；溶液精密度、重复性均良好；在12 h内测定，其稳定性最佳；溶液加样回收实验考察得平均回收率为97.4%，RSD = 2.8%。5批干蟾皮药材的含量分别为0.012、0.009、0.013、0.011、0.007 mg/g，平均含量为0.010 mg/g。 结论 本方法建立的色谱条件科学、快速、稳定，可作为干蟾皮药材内在质量的控制方法。
　　[关键词] 干蟾皮；华蟾酥毒基；高效液相色谱法；含量测定
　　[中图分类号] R284.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）06（b）-0116-03
　　干蟾皮是两栖纲蟾蜍科动物中华大蟾蜍或黑眶蟾蜍去除内脏的干燥体[1]，其全身均可供药用。干蟾皮是一种使用广泛的药材，性寒味苦，具有破结、消疳积、行水、解毒、杀虫、定痛等功效[2-5]。用于治疗小儿疳积、慢性气管炎臃肿疔毒等症病。现代药理实验表明干蟾皮对肿瘤亦有抑制作用，我国多用来治疗原发性肝、肺癌及肠癌等，其制剂如华蟾素注射液在临床上也有广泛应用，主要治疗中晚期消化道癌、肝炎等，效果明显。干蟾皮的主要抗肿瘤活性成分为蟾酥毒类成分，如蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基等[6]。近年来有关蟾皮有效成分的提取、分离及鉴定研究较多[7-9]。蟾皮的主要提取方法有水煎煮法、超声法、回流提取法等。本研究采用DM130树脂动态处理干蟾皮提取液的方法进行了研究，对干蟾皮中华蟾酥毒基进行了含量测定，不仅能高效提取指标成分，且减少了杂质的溶出，提高华蟾酥毒基的系统适应性，控制了干蟾皮的内在质量。
　　1 仪器与试药
　　1.1 仪器
　　高效液相色谱仪：SSI-Ⅲ型双元液相泵、Molde紫外检测器（美国SSI）；万分之一电子分析天平（德国塞多利斯）；旋转蒸发仪（上海豫康）；KQ-250超声波清洗器（上海昆山）；DM130大孔吸附树脂柱（内径1.5 cm，长12 cm）。
　　1.2 试剂
　　乙腈（色谱纯，美国TEDIA）；水为纯净水， 其余试剂均为市售分析纯。
　　1.3药品
　　对照品：华蟾酥毒基（中国生物制品检定所，批号：110803-200504）；样品：干蟾皮，来源于浙江省富阳市中医医院中药房。
　　2 方法
　　2.1 色谱条件的选择
　　参照《中国药典》2010年版一部蟾酥项下测定方法[2]。色谱柱：Waters XbridgeC18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：0.5%磷酸二氢钠溶液-乙腈（52∶48）加磷酸调pH 3.2； 检测波长为294 nm；流速：1 mL/min；柱温为室温。华蟾酥毒基色谱见图1，结果示华蟾酥毒基峰的保留时间在15.330 min。
　　2.2 标准品溶液的配制
　　精密称取经五氧化二磷干燥24 h的华蟾酥毒基对照品5 mg，至于50 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，即得浓度为0.1 mg/mL的华蟾酥毒基溶液。
　　2.3 供试品溶液的制备
　　称取干蟾皮粗粉5 g，加石油醚（每次30 mL）超声脱脂，每次30 min，共脱脂2次，残渣挥去石油醚，加甲醇50 mL超声提取30 min，提取3次，过滤，合并滤液，滤液蒸干，残渣加10 mL水微热溶解，过DM130大孔吸附树脂柱（内径1.5 cm，长12 cm），用40 mL水洗，弃去水液，再以50 mL 50%乙醇洗，弃去50%乙醇洗液，继以70%乙醇洗，收集70%乙醇液，蒸干，残渣分别加甲醇溶解转移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，即得供试品溶液。
　　2.4 线性关系考察
　　精密吸取华蟾酥毒基对照品溶液2.5、5.0、7.5、10、12.5、15 mL，于100 mL量瓶中，加甲醇至刻度。分别吸取10 μL注入高效液相，测定峰面积。以对照品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，得方程y = -4×107x -10 196（r = 0.9999），表明华蟾酥毒基在进样量2.5～15.0 μg（r = 0.9999）范围内呈良好的线性关系。华蟾酥毒基标准曲线见图2。
　　2.5 精密度试验考察
　　精密吸取同一浓度对照品溶液注入高效液相色谱仪，重复5次，测定峰面积，结果显示蟾酥毒基峰5次峰面积分别为410 395、415 812、407 237、416 503、412 962 mAU，RSD为0.93%。表明所用仪器具有良好的精密度。
　　2.6 重复性试验考察
　　取同一批号干蟾皮药材粗粉5份，分别按供试品制备方法制备供试品溶液，于上述色谱条件测定，计算华蟾酥毒基峰面积。结果显示其5次峰面积分别为446 245.5、432 267.5、444 791.5、412 962.0、450 377.0 mAU，RSD为3.54%，表明该方法具有良好的重复性。
　　2.7 稳定性实验考察
　　精密吸取同一供试品溶液，按色谱条件于0、3、5、7、12 h测定，结果华蟾酥毒基峰面积分别为445 225.0、431 234.5、440 294.5、433 962.0、426 311.0 mAU，RSD为3.12%，表明华蟾酥毒基稳定性良好，在12 h内测定最佳。

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