茜草等25种中药材对5种植物病原真菌的抑制活性

　　摘要
　　以苹果腐烂病菌、苹果轮纹病菌、棉花枯萎病菌、柑橘炭疽病菌与白菜黑斑病菌为供试菌，采用生长速率法测定25种中药材甲醇粗提物的抑菌活性。结果表明，在浓度为5.0 mg/mL时，大部分中药材的甲醇粗提物对至少一种植物病原真菌都表现出不同程度的抑制活性，其中知母、青蒿、细辛与白鲜皮对3种供试植物病原菌的抑制率大于75%，而茜草与姜黄对4种供试植物病原菌的抑制率均在80%以上，具有广泛的抑菌谱。进一步采用系统溶剂法得到的茜草不同溶剂萃取物中，水饱和正丁醇相抑菌活性明显优于石油醚及乙酸乙酯相，表明茜草抑菌活性成分主要为中等及大极性化合物。
　　关键词
　　中药材；茜草；甲醇提取物；植物病原真菌；抑制活性
　　中图分类号：
　　S 482.292
　　文献标识码：A
　　DOI：10.3969/j.issn.05291542.2015.04.020
　　我国药用植物资源十分丰富，仅中药典籍《本草纲目》中收录就超过1 000种，其中相当一部分具有抑菌或杀虫活性。因此，借鉴传统药用植物医用研究成果，研究其对植物病害的防治作用，已经成为国内外开发植物源农药的重要途径[1]。药用植物是提取结构新颖、活性独特的天然产物的重要资源，可从中发掘具有较好农用抑菌活性的先导化合物，进而开发植物源农药[2]。近年来，西北农林科技大学无公害农药研究服务中心从苦豆子[3]、大花金挖耳[4]、孜然[5]等药用植物中，陆续发现了天名精内酯酮和天名精内酯醇[6]、枯茗醛和枯茗酸[7]等抑菌活性成分，有望进一步开发为农用杀菌剂。本论文选取了25种记载有医用抑菌活性的中药材，对其抑制植物病原真菌活性进行了筛选，旨在为发掘抑菌活性先导化合物奠定基础。
　　1.2供试植物病原真菌
　　苹果腐烂病菌（Valsa mali）、苹果轮纹病菌（Botryosphaeria dothidea）、棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp. vasinfectum）、柑橘炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）与白菜黑斑病菌（Alternaria brassicae）由山东省农业仿生工程应用技术研究中心提供，并经青岛农业大学农学与植物保护学院金静教授鉴定。供试菌株接种在PDA斜面上，4 ℃冰箱保存。使用前，接种至PDA平板表面，25 ℃恒温培养3～4 d备用。
　　1.3中药材甲醇粗提物与茜草不同溶剂萃取物的制备
　　分别称取各中药材粉末50 g，用300 mL甲醇浸泡1 h后，超声波振荡提取30 min，减压抽滤，滤渣再采用上述方法处理，重复3次。合并滤液，减压浓缩，冷冻干燥得到中药材甲醇粗提物，密封后置于4 ℃冰箱保存。
　　对初筛具有较好抑菌活性的茜草甲醇粗提物，采用系统溶剂法制备不同极性溶剂的萃取物，进一步考察其抑菌活性。将茜草的甲醇粗提物以一定量水混悬，依次用石油醚、乙酸乙酯及水饱和正丁醇进行萃取，所得萃取液及剩余的水相经浓缩干燥，得到茜草不同极性溶剂的萃取物，密封后置于4 ℃冰箱保存。
　　1.4抑菌活性的离体测定
　　采用菌丝生长速率法测定供试中药材甲醇粗提物及茜草不同溶剂萃取物的抑菌活性。称取适量甲醇粗提物，以50%乙醇混悬，加入到融化的无菌PDA培养基（约50 ℃）中混匀，得到浓度为5.0 mg/mL的含药培养基平板。培养基中乙醇的含量小于3%，以含等量乙醇的PDA培养基作为对照，每处理3次重复。
　　称取适量的茜草不同溶剂萃取物，以50%乙醇混悬，采用上述方法配制成1.0 mg/mL的含药培养基平板。培养基中乙醇的含量小于3%，设置含等量乙醇的溶剂对照，每处理3次重复。
　　用打孔器打取生长一致的植物病原真菌菌饼（6 mm），接种于含药PDA平板以及对照PDA平板的中央（菌饼长满菌丝一面向下），25 ℃恒温培养，待对照平板长满菌丝时，采用十字交叉法测定菌落直径，并按以下公式计算抑制率：
　　纯生长量（mm）=菌落平均直径-菌饼直径；
　　抑制率（%）=
　　对照菌落纯生长量-处理菌落纯生长量对照菌落纯生长量×100。
　　1.5茜草与姜黄甲醇粗提物对植物病原真菌的毒力测定
　　以茜草与姜黄甲醇粗提物抑菌率较高的植物病原真菌为供试菌种，按照1.4所述方法，依次配制得到浓度为2.5、1.0、0.75、0.5与0.25 mg/mL的含药培养基平板，以加入等量溶剂的平板为对照，每处理3次重复。试验数据用SPSS 17.0对药剂浓度的对数（x）与校正抑制率的几率值（y）进行回归分析，得到毒力回归方程、相关系数及抑制中浓度（EC50）。
　　2结果与分析
　　2.1中药材甲醇粗提物的抑菌活性
　　供试中药材的甲醇粗提物浓度为5.0 mg/mL时，25种中药材甲醇粗提物中有14种分别对至少1种植物病原真菌的抑制率大于75%，占供试样品的56%，分布于13个科；而知母、姜黄、青蒿、细辛、白鲜皮与茜草对至少3种供试植物病原菌的抑制率大于75%，具有广泛的抑菌谱。其中，茜草甲醇粗提物对苹果腐烂病菌、苹果轮纹病菌与柑橘炭疽病菌的抑制率均大于90%，对棉花枯萎病菌也大于85%，值得进一步深入研究；而姜黄甲醇粗提物对除苹果轮纹病菌外的4种供试植物病原菌也表现出较好的抑制活性，抑制率均大于80%（表2）。
　　中药材甲醇粗提物抑菌活性的选择性明显。近40%的中药材甲醇粗提物分别对苹果腐烂病菌、苹果轮纹病菌与柑橘炭疽病菌有较好抑制活性，抑制率均大于75%；其中车前草甲醇粗提物对苹果腐烂病菌与苹果轮纹病菌的抑制率均大于95%，但对其余供试植物病原菌没有抑制活性，具有明显的选择性。而对白菜黑斑病菌有较好抑制活性的仅有姜黄与五倍子甲醇粗提物，抑制率分别为80.6%与86.0%。此外，仅有姜黄、茜草与细辛甲醇粗提物对棉花枯萎病菌的抑制率大于75%，其余均小于60%。

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