课题1,微生物实验室培养

　专题 2 微生物的培养与应用

　在缤彩纷呈的生物世界，微生物似乎显得过于微小与沉寂。然而，它们在自然界却作用非凡！

　生物学发展的历史表明，诸多革命性地改变人类对生命的认识的事件，都与微生物有着千丝万缕的联系。例如，自然发生说的破灭，酶的原始概念“酵素”的提出，肺炎双球菌转化实验证明 DNA是遗传物质，青霉素的发现，第一个杂合 DNA分子的体外构建„„ 在借助显微镜第一次直面微生物之后，一代又一代科学家建立、发展和完善了微生物技术。课题 1将带领我们学习这些技术中最基本、最核心的微生物培养技术。在此基础上，我们不妨也尝试一下本专题中的其他课题。相信在逐步深入的探索中，你能充分体会到动手动脑做科学的乐趣。

　课题 1 微生物的实验室培养 课题背景 19 世纪中期，关系到法国经济命脉的酿造业曾一度遭受殷灭性的打击。在生产过程中，出现了葡萄酒变酸、变味的怪事。经过一番研究，法国科学家巴斯德发现，导致生产失败的根源在于发酵物中混入了杂菌。由此人们认识到保持培养物纯净的重要性。

　防止杂菌入侵，获得纯净的培养物，是研究和应用微生物的前提。在实验室培养微生物，一方面需要为培养的微生物提供合适的营养和环境条件，另一方面需要确保无处不在的其他微生物无法混入。在本课题中，我们将通过培养大肠杆菌（ Escherichia coil ）的实验，学习微生物培养的基本技术。

　基础知识 （一）培养基 人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质——培养基（culture media）。其中，配制成的液体状态的基质称为液体培养基，配制成的固体状态的基质称为固体培养基。在液体培养基中加入凝固剂琼脂后，制成琼脂固体培养基，它是实验室中最常用的培养基之一。微生物在固体培养基表面生长，可以形成肉眼可见的菌落（图 2-1）。

　 虽然各种培养基的具体配方不同，但一般都含有水、碳源（提供碳元素的物质）、氮源（提供氮元素的物质）和无机盐。回忆有关活细胞中元素组成的知识，想一想为什么大多数培养基都含有这四类物质。下面让我们一起来看一看某种细菌培养基的营养构成。

　在提供上述几种主要营养物质的基础上，培养基还需要满足微生物生长对 pH、特殊营养物质以及氧气的要求。例如，培养乳酸杆菌时需要在培养基中添加维生素，培养霉菌时需将培养基的 pH调至酸性，培养细菌时需将 pH调至中性或微碱性，培养厌氧微生物时则需要提供无氧的条件。

　? 琼脂（agar）是一种从红藻中提取的多糖。琼脂在 98℃以上熔化，在 44℃以下凝固，在常规培养条件下呈现固态。

　? 牛肉膏和蛋白胨来源于动物原料，含有糖、维生素和有机氮等营养物质。

　? 你想知道固体培养基的来历吗？请点击人教网 www.pep.com.cn 查询。

　（二）无菌技术 获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵。无菌技术围绕着如何避免杂菌的污染展开，主要包括以下几个方面。

　1.对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒（disinfection）

　。

　2.将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌（sterilization）。

　3.为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行。

　4.实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。

　无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？ ? 消毒是指使用较为温和的物理或化学方法杀死物体表面或内部的部分微生物（不包括芽孢和孢子）。灭菌则是指使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。下面，我们重点学习消毒和灭菌的方法。

　实验室常用的消毒和灭菌方法 在实验室中，切不可吃东西、喝水，离开实验室时一定要洗手，以防止被微生物感染。使用后的培养基丢弃前一定要进行灭菌处理，以免污染环境。

　消毒方法 日常生活中经常用到煮沸消毒法。在 100℃煮沸 5~6min 可以杀死微生物细胞和一部分芽孢。对于一些不耐高温的液体，如牛奶，则使用巴氏消毒法，在 70~75℃煮 30min 或在 80℃煮 15 min，可以杀死牛奶中的微生物，并且使牛奶的营养成分不被破坏。此外，人们也常使用化学药剂进行消毒，如用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源等。

　灼烧灭菌 将微生物的接种工具，如接种环、接种针或其他金属用具，直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧，可以迅速彻底地灭菌（图 2-2）。此外，在接种过程中，试管口或瓶口等容易被污染的部位，也可以通过火焰灼烧来灭菌。

　干热灭菌

　将灭菌物品放入干热灭菌箱（图 2-3）内，在 160~170℃加热 1~2 h 可达到灭菌的目的。能耐高温的、需要保持干燥的物品，如玻璃器皿（吸管、培养皿）和金属用具等，可以采用这种方法灭菌。干热灭菌的具体操作步骤参见附录 4。

　高压蒸汽灭菌

　将灭菌物品放置在盛有适量水的高压蒸汽灭菌锅（图 2-4 ）内。把锅内的水加热煮沸，将其中原有的冷空气彻底排除后，将锅密闭，继续加热使锅内的气压逐步上升，温度也随之升到 l00℃以上。为达到良好的灭菌效果，一般在压力为 100 kPa，温度为 121℃的条件下，维持 15~30min。高压蒸汽灭菌的具体操作步骤参见附录 4。

　除了以上方法外，实验室里还用紫外线或化学药物进行消毒。例如，接种室、接种箱或超净工作台在使用前，可以用紫外线照射 30 min，以杀死物体表面或空气中的微生物。在照射前，适量喷洒石炭酸或煤酚皂溶液等消毒液，可以加强消毒效果。实验室中常用的其他化学消毒剂，参见附录 5。

　清你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。

　1.培养细菌用的培养基与培养皿。

　2.玻棒、试管、烧瓶和吸管。

　3.实验操作者的双手。

　实验操作 ? 教学用的大杨杆菌可以到国家指定的菌种保藏中心购买。

　本实验用牛肉膏蛋白胨固体培养基进行大肠杆菌的纯化培养，可分成制备培养基和纯化大肠杆菌两个阶段进行。

　（一）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基 1. 计算

　根据牛肉膏蛋白胨培养基配方的比例，计算配制 100mL 的培养基时，各种成分的用量。

　? 牛肉膏蛋白胨固体培养基配方 牛肉膏

　 5.0g 蛋白胨

　 10.0g NaCl

　5 .0g 琼脂

　20 .0g 将上述物质溶解后，用蒸馏水定容至 1 000 mL。

　2. 称量

　准确地称取各种成分。牛肉膏比较粘稠，可以用玻棒挑取，放在称量纸上称量。牛肉膏和蛋白胨都容易吸潮，称取时动作要迅速，称后要及时盖上瓶盖。

　3. 溶化

　将称好的牛肉膏连同称量纸一同放入烧杯，加入少量的水，加热。当牛肉膏溶化并与称量纸分离后，用玻棒取出称量纸。往烧杯中加入称量好的蛋白胨和氯化钠，用玻棒搅拌，使其溶解。加入琼脂，加热使其熔化。在此过程中，不断用玻棒搅拌，防止琼脂糊底而导致烧杯破裂。当琼脂完全熔化后，补加蒸馏水至 100mL 。

　4. 灭菌

　将配制好的培养基转移到锥形瓶中，加棉塞，包上牛皮纸，并用皮筋勒紧，再放入高压灭菌锅，在压力为 100kPa、温度为 121℃条件下，灭菌 15~30min。将培养皿用几层旧报纸包紧，5~8套培养皿作一包，包好后放入干热灭菌箱内，在 160~170℃下灭菌 2 h。

　5. 倒平板

　待培养基冷却至 50℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板。倒平板的具体操作描述如下。

　倒平板操作 1.将灭过菌的培养皿放在火焰旁的桌面上，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拔出棉塞。

　2.右手拿锥形瓶，使瓶口迅速通过火焰。

　3.用左于将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中的培养基（约 10~20mL）倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖。

　4.等待平板冷却凝固（大约需 5~10min）后，将平板倒过来放置，使皿盖在下、皿底在上。

　讨论 1.培养基灭菌后，需要冷却到 50℃左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？ 2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？ 3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？ 4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？ （二）纯化大肠杆菌 微生物接种的方法很多，最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法。请你选用其中的一种方法，在牛肉膏蛋白胨固体培养基上纯化大肠杆菌。

　? 微生物的接种技术还包括斜面接种、穿刺接种等方法。虽然这些技术的操作方法各不相同，但是，其核心都是要防止杂菌的污染，保证培养物的纯度。

　平板划线法是通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，这就是菌落（colony）。

　1.将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环烧红。

　2.在火焰旁冷却接种环，并打开盛有菌液的试管的棉塞。

　3.将试管口通过火焰。

　4.将已冷却的接种环伸入菌液中，沾取一环菌液。

　5.将试管口通过火焰，并塞上棉塞。

　6.左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线，盖上皿盖。注意不要划破培养基。

　7.灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的末端开始往第二区域内划线。重复以上操作，在三、四、五区域内划线。注意不要将最后一区的划线与第一区相连。

　讨论 1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？ 2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？ 3.在做第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？ 稀释涂布平板法则是将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。

　系列稀释操作

　1.将分别盛有 9mL水的 6 支试管灭菌，并按 10 1 ~10 6 的顺序编号。

　2.用移液管吸取 1 mL 培养的菌液，注入 10 1 倍稀释的试管中。用手指轻压移液管上的橡皮头，吹吸三次，使菌液与水充分混匀。

　3.从 10 1 倍稀释的试管中吸取 1 mL 稀释液，注入 10 2 倍稀释的试管中，重复第 2 步的混匀操作。依次类推，直到完成最后一支试管的稀释。

　注意：移液管需要经过灭菌。操作时，试管口和移液管应在离火焰 1~2cm处。

　涂布平板操作

　l.将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。

　2.取少量菌液（不超过 0.1mL），滴加到培养基表面。

　3.将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后，冷却 8~10s。

　4.用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使菌液分布均匀。

　注意：1.将涂布器末端浸在盛有体积分数为 70%的酒精的烧杯中。取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃。

　2.操作中一定要注意防火！不要将过热的涂布器放在盛放酒精的烧杯中，以免引燃其中的酒精。

　讨论 涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第 2步应如何进行无菌操作？ 将接种后的培养基和一个未接种的培养基都放入 37℃恒温箱中，培养 12h 和 24 h 后，分别观察并记录结果。

　结果分析与评价 1.未接种的培养基表面是否有菌落生长？如果有菌落生长，说明了什么？ 2.在接种大肠杆菌的培养基上，你是否观察到了独立的菌落？这些菌落的颜色、形状和大小相似吗？ 3.培养 12 h和 24 h 后，观察到的实验结果相同吗？如果不同，请分析产生差异的原因。

　4.如果你在培养基上观察到了不同形态的菌落，你能分析出可能是由哪些原因引起的吗？ 5.你是如何记录实验结果的？与其他同学交流互评。

　课题延伸 为了保持菌种的纯净，需要进行菌种的保藏。对于频繁使用的菌种，我们可以采用临时保藏的方法。首先，将菌种接种到试管的固体斜面培养基上，在合适的温度下培养。当菌落长成后，将试管放入 4℃的冰箱中保藏（图 2-5）。以后每 3~6 个月，都要重新将菌种从旧的培养基上转移到新鲜的培养基上。但是，这种方法保存的时间不长，菌种容易被污染或产生变异。

　对于需要长期保存的菌种，可以采用甘油管藏的方法。在 3mL 的甘油瓶中，装人 1 mL 甘油后灭菌。将 1 mL 培养的菌液转移到甘油瓶中，与甘油充分混匀后，放在-20℃的冷冻箱中保存。

　练习 习 1.请你想一想，日常生活中保存食品的方法有哪些？这些方法是如何阻止或抑制微生物生长的？

　2.无土栽培技术是用人工配制成的培养液来栽培植物；植物组织培养技术则是将植物体的组织接种在培养基上进行离体培养；而在本课题中，我们着重学习了微生物的培养技术。请你比较这三种培养技术在设计思路和具体操作上的异同。

　3.巴斯德设计的鹅颈瓶实验有力地驳斥了“自然发生论”，证明微生物只能由微生物产生，不能从没有生命的物质自然产生。请你解释其实验原理，并分析这个实验对于微生物学的进步、微生物学的研究方法以及食品保存等方面所产生的影响。

相关热词搜索：微生物 课题 实验室